无花果采后炭疽病原菌鉴定及贝莱斯芽孢杆菌防治效果

杨婉艺，姜 毅，汤 静，席 飞，孙佩馨，肖红梅*

（南京农业大学食品科学技术学院，江苏 南京 210095）

无花果（Ficus caricaL.）风味独特、肉质鲜美，富含糖类、纤维素、维生素、矿物质和多种氨基酸[1]，是酚类物质的良好来源，具有优秀的抗氧化能力[2]。但无花果皮薄多汁，采后呼吸代谢旺盛，其果目结构又极易遭受病原微生物的侵染，因此会造成严重的采后病害。炭疽病是无花果采后主要病害之一[3]，病状为褐色的圆形病斑，随着病害程度加重，病斑面积不断扩大，使果实软化腐烂，失去食用价值。炭疽菌侵染寄主类型的范围甚为广泛，不同的寄主中均具有1 种或多种优势炭疽菌株[4]，明确无花果炭疽病原体的种属对无花果炭疽病的防控具有重要的意义。由于炭疽菌的分生孢子、附着胞、菌落形态等特征稳定性差，且利用单一的内源转录间隔区（internally transcribed spacer，ITS）基因序列鉴定往往难以准确划分炭疽菌归属复合种下的生理小种[5]，而多基因联合鉴定能够很好地区分亲缘关系较近的小种，多基因序列联合鉴定的物种进化研究方法逐渐成为植物病菌菌株鉴定常用的有效方法之一[6]。

炭疽病的频发限制了无花果产业的发展，寻找一种合适的防控技术迫在眉睫。目前，农业上主要采用传统的化学方法防控无花果的炭疽病害，但化学物质的长期超量使用容易造成药物残留、环境严重污染、病菌耐药性增强等问题[3,7]。生防菌的应用可以有效规避或减轻化学药剂所带来的问题[8]，绿色安全健康的生物防治成为国内外的研究热点。芽孢杆菌属（Bacillusspp.）是生防菌的主要微生物之一，许多种[9-11]都对炭疽菌的生长具有抑制能力，且对果蔬炭疽病的防治应用效果往往优于假单胞杆菌属（Pseudomonassp.）[12-13]、木霉属（Trichodermasp.）[14-15]等拮抗微生物。其中，贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）已被证实可以有效控制多种果蔬真菌病害如番茄早疫病[16]、苹果灰霉病[17]、芒果炭疽病[18]和细菌病害如柑橘细菌性溃疡病[19]、香蕉软腐病[20]，具有优秀的生防应用潜力。芽孢杆菌一方面可以产生对病原菌有直接杀伤作用的抑菌物质[21]；另一方面，芽孢杆菌还可以通过诱导寄主抗病基因的表达增强果实的抗病性[22]，从而减少采后病害的发生。目前鲜见贝莱斯芽孢杆菌防控无花果炭疽病相关研究与报道。

2022年中央一号文件强调“推进农业农村绿色发展”“深入推进农业投入品减量化”。病原菌的分离、鉴定是分析无花果病害流行规律的前提。本课题组从具有典型炭疽病发病症状的无花果病果上获得一株炭疽病菌FC.006（以下简称FC.006），前期研究发现，生防菌B.velezensisRD.006（以下简称RD.006）对FC.006菌丝生长具有显著抑制作用；果实异孔接种实验证明RD.006可以诱导提高果实对FC.006的抵御能力；RD.006处理能够降低采后‘布兰瑞克’无花果的病情指数，有效保持果实品质。在此基础上，本实验采用多基因序列联合鉴定FC.006的基因序列，同时进一步探究RD.006对其的防治效果，以期为无花果采后病害的鉴定和生物防治提供理论基础，为我国农林产业“两减一增”战略实施和相关技术提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensisRD.006）保存于LB培养基（4 ℃）。

‘布兰瑞克’无花果果实，采摘于江苏省句容市虎耳山无花果专业合作社，采后2 h内运回实验室。挑选具有明显炭疽病发病症状的果实用于病原菌的分离；挑选色泽统一、大小一致、无机械损伤、无病虫害的健康果实用于贮藏保鲜实验。

1.2 仪器与设备

HVE-50自动蒸汽灭菌锅 日本Hirayama有限公司；HP-2136便携式色差仪 上海谱熙光电科技有限公司；UV BlueStar A紫外-可见分光光度计 北京莱伯泰科仪器有限公司；TGL20M台式高速冷冻离心机 湘潭湘仪仪器有限公司；WYT-4型手持糖量仪 绍兴市亿纳仪器制造有限公司；102光学显微镜 日本尼康公司；恒温恒湿培养箱 宁波海曙赛富实验仪器厂；XB-K-25血球计数板 上海医用光学仪器厂；HH-6恒温水浴锅常州国华电器有限公司；NanoDrop2000分光光度计、QuantStudioTM6 Flex实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）系统 美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 无花果采后病原菌的分离与鉴定

1.3.1.1 病原菌株的分离与纯化

选取‘布兰瑞克’典型病果，采用组织分离法进行病原菌株的分离。切取病果病健交界处组织块，依次放入体积分数75%乙醇10 s、质量分数1%次氯酸钠溶液20 s，随后用无菌水漂洗3 次，切取组织块中央的部分（约5 mm×5 mm）于无菌滤纸上吸干组织表面水分，用无菌镊子将组织块置于PDA培养基上，倒置培养皿于25 ℃恒温培养箱中黑暗培养3～5 d，用无菌接种针挑取单菌落边缘菌丝于新的PDA培养基上进行纯化，重复2～3 次直至得到纯化的菌株，观察菌株的菌落形态、菌丝和孢子的形态特征。结合《真菌鉴定手册》[23]对病原菌进行初步鉴定。将分离纯化的菌株回接于健康的‘布兰瑞克’果实，根据科赫法则验证分离菌株的致病性，获得致病菌株。

1.3.1.2 病原菌株多基因联合生物学鉴定

利用十六烷基三甲基溴化铵（c e t y l t r i m e t h y l ammonium bromide，CTAB）法[5]提取25 ℃培养7 d的菌丝体DNA。取100 mg菌丝体于装有500 μL CTAB裂解液（提前65 ℃预热）的离心管中，65 ℃水浴1 h，水浴期间每隔 10 min振荡一次，水浴结束后室温冷却，加入500 mL氯仿-异戊醇溶液（体积比24∶1，下同），翻转混匀，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，吸取上清液转移至新的离心管中，加入等体积氯仿-异戊醇溶液，重复抽提一次。向上清液中加入2 倍体积的无水乙醇，置于4 ℃冰箱过夜沉淀DNA，在4 ℃、12 000 r/min条件下离心15 min，弃去上清液。用体积分数70%乙醇洗涤沉淀2 次，弃上清液。待残余乙醇挥发之后加入适量1×TE缓冲液溶解。取部分样品分别用于1%的琼脂糖凝胶电泳和浓度检测，质量合格的样品置于－20 ℃冰箱中保存待用。

基于各基因序列引物（表1）进行PCR扩增反应，反应程序为：预变性4 min，95 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 个循环；72 ℃延伸7 min。扩增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，有清晰条带的PCR产物送北京擎科生物科技有限公司进行测序，将所得结果在GenBank数据库中与己知同源序列进行同源性比较，利用MEGA-X软件通过邻近法构建系统发育树。

表1 病原菌株多基因序列引物Table 1 Primers used for amplification of multiple gene sequences of pathogenic strains

1.3.2 FC.006的致病孢子浓度筛选

取健康的无花果果实，体积分数75%乙醇消毒20 s，用无菌水冲洗3 次，自然晾干后，在果实腰部用灭菌打孔器形成1 个直径3 mm、深4 mm的圆孔，在圆孔处分别接种20 μL FC.006孢子悬液：1×103、1×104、1×105、1×106、1×107个/mL，并设置FC.006菌碟贴于果实伤口处（菌碟菌丝朝向果肉）阳性对照和无菌水阴性对照。自然晾干后，用聚乙烯保鲜袋单果包装，置于25℃、相对湿度85%～95%的恒温培养箱中存放，分别于3 d和5 d时采用十字交叉法测定果实发病直径，以筛选后续实验中孢子使用浓度。

1.3.3 贝莱斯芽孢杆菌RD.006对FC.006的离体抑制效果测定

在P DA 平板中央打孔，接入培养7 d 的病原菌FC.006，用无菌接种针在病原菌两侧平行划线接入RD.006（距平板中央大约2.5 cm），在28 ℃、相对湿度90%～95%的条件下培养4～12 d。以仅接种病原菌的平板作为对照，从平板背面采用十字交叉法测量病原菌菌落的直径大小，并根据以下公式计算抑菌率。

1.3.4 贝莱斯芽孢杆菌RD.006对无花果果实炭疽防治效果检测

果实消毒和打孔处理同1.3.2节，对果实接种以下处理液20 mL：1）FC组：1×105个/mL FC.006孢子悬液；2）RD组：1×108个/mL RD.006菌悬液；3）FC-RD组：先接种1×105个/mL FC.006孢子悬液，24 h后接种1×108个/mL RD.006菌悬液；4）RD-FC组：先接种1×108个/mL RD.006菌悬液，24 h后接种1×105个/mL FC.006孢子悬液。

接种完毕室温自然晾干后，用聚乙烯保鲜袋单果包装，置于25 ℃、相对湿度85%～95%的恒温培养箱中贮藏。每组处理3 个平行，每平行15 个果实。贮藏5、7 d时测量果实的病斑直径。

1.3.5 无花果果实抗性基因表达量的测定

果实处理方式同1.3.4节中FC组和RD-FC组接种方式，每组设置3 个平行，每平行75 个果实。在第二次接种完成后的0、12、24、48、54、72 h后，用灭菌的手术刀取果实伤口周围1 cm宽的组织，放入液氮中速冻，再置于－80 ℃冰箱中保存备用，提取果实组织样品RNA进行相关基因表达量测定。

采用改良CTAB法[28]提取无花果总RNA，反转录和去除基因组DNA采用Takara RR047A试剂盒方法操作，通过1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测上述提取RNA样品的质量和浓度，合格样品用于后续的qPCR反应。基因表达水平的测定采用Takara RR420A试剂盒的方法操作，采用ABI 7500 system qPCR仪器研究无花果果实6 个抗病相关基因的表达。相关引物如表2所示。上机反应条件为：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，共40 个循环。将反应结果用阈值周期（CT值）进行归一化处理，用2−ΔΔCT法表示目标基因相对于管家基因（Actin）的相对表达水平。

表2 无花果相关抗病基因引物Table 2 Primers for amplification of disease resistance genes in fig fruits

1.4 数据分析

采用SAS 8.2软件进行Duncan’s多重比较，P＜0.05表示差异显著；图表用Excel、Graphpad软件进行绘制。

2 结果与分析

2.1 无花果采后病原菌株FC.006的分离与鉴定

2.1.1 病原菌FC.006形态鉴定结果

从无花果病果上分离得到一株病原菌株（图1A）。依据科赫法则，将其接种至无花果上进行回接验证致病性并再次分离，得到再分离菌株FC.006（图1B），显微镜下观察其菌丝细长，表面较平滑，存在部分分支（图1C）。FC.006在PDA培养基上形成的菌落边缘规则，颜色由中央黑褐色向外扩至四周颜色变淡至边缘带呈白色，在培养后期菌落背面处可以观察到黑色附着胞形成的轮纹状特征，易产生橙色分生孢子堆，分生孢子呈柱形，两端钝圆（图1D）。

图1 病原菌株FC.006的形态特征Fig.1 Morphological characteristics of FC.006

2.1.2 病原菌FC.006的多基因序列分析鉴定

无花果病原菌株FC.006经rDNA-ITS序列初步鉴定为胶孢刺盘孢复合种（Colletotrichum gloeosporioides），对ITS-GAPDH-TUB-CHS-ACT-CAL6 个基因联合序列与表3所示的模式菌株序列进行同源性比较，并构建系统发育树（图2），FC.006鉴定为胶孢刺盘孢下的小种哈锐炭疽菌（C.Horii）。

图2 FC.006的多基因序列联合构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of FC.006 based on multigene sequence combination

表3 多基因联合鉴定分离菌株FC.006胶孢刺盘孢复合种系统发育树分析中相关模式菌株信息Table 3 Information about type strains used for multi-gene phylogenetic analysis for identification of Colletotrichum gloeosporioides FC.006

2.1.3 FC.006的致病孢子浓度筛选结果

哈锐炭疽菌FC.006的孢子能够有效引起无花果炭疽病的发生。无花果果实炭疽病害发病初期伤口周围发黑，后期黑色病斑逐渐扩大，呈轮纹状且向内凹陷，并伴有白色菌丝和橙色孢子产生，果实软烂且果目渗有腐烂汁水。由图3可知，在设置的接种范围（1×103～1×107个/mL）内，随着孢子接种浓度的增高，果实的病斑直径增加，果实炭疽病发病情况严重程度加大。接种孢子浓度1×105个/mL和1×106个/mL果实的病斑直径接近，在接种3 d和5 d时，病斑直径分别约为1.5 cm和2.4 cm；接种5 d时，接种孢子浓度1×107个/mL的果实完全腐烂。感染低孢子浓度（1×103个/mL）的果实显现较为轻微的病状，果实组织对病原菌侵染具有一定的抵御能力；接种高孢子浓度（1×106个/mL和1×107个/mL）的果实发病严重，果实组织快速进入死亡状态；孢子中间浓度（1×104个/mL和1×105个/mL）侵染引起果实较为严重的炭疽病，果实发病进程适中，因而接种1×105个/mL孢子浓度果实的生理状态可用于本实验后续研究。

图3 接种FC.006不同孢子浓度的无花果果实5 d时发病情况（A）和病斑直径（B）Fig.3 Disease symptom (A) and lesion diameter (B) of fig fruits at 5 days after inoculation with different spore concentrations of FC.006

2.2 贝莱斯芽孢杆菌RD.006对炭疽菌FC.006的抑制作用

在RD.006和FC.006对峙平板上发现，RD.006对FC.006具有明显的抑制作用，加入RD.006后，FC.006的生长直径明显变小，菌落呈现规则的梭形；在RD.006的生物胁迫下，FC.006已显示出逆境下的特殊生理形态，菌落中央提前生成了橙色的孢子（图4B）。培养至8 d时，对照组FC.006菌落已生长至整个平板（图4A），此时RD.006的抑菌率达到85%（图5），对峙平板中FC.006菌落停止扩展且与RD.006之间存在着明显的抑菌带。

图4 贝莱斯芽孢杆菌RD.006对炭疽菌FC.006的抑菌效果Fig.4 Antimicrobial effect of Bacillus velezensis RD.006 on FC.006

图5 贝斯芽孢杆菌RD.006对炭疽菌FC.006的抑菌率Fig.5 Inhibition rate of Bacillus velezensis RD.006 against FC.006

2.3 贝莱斯芽孢杆菌RD.006对无花果炭疽病的防治效果

如图6所示，在贮藏5 d时，RD-FC组的果实病斑直径显著小于FC组和FC-RD组果实（P＜0.05）；贮藏7 d时，RD-FC组果实的病斑直径是同时期FC组果实的41.5%，而FC-RD组果实的病斑直径达2.3 cm，与此时只接种病原菌的FC组果实病斑直径接近，说明预防接种贝莱斯芽孢杆菌RD.006对无花果采后炭疽病有良好的防控作用，且提前接种生防菌的接种方式有助于降低感染炭疽病果实腐烂的严重程度，这可能是因为提前接种生防菌会诱导果实组织产生更强的抗病性。

图6 贝莱斯芽孢杆菌RD.006对无花果炭疽病害的预防和防治作用Fig.6 Preventive and control effects of Bacillus velezensis RD.006 on anthracnose disease of fig

2.4 贝莱斯芽孢杆菌RD.006对无花果果实抗性基因的影响

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonialyase，PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）和4-香豆酰-辅酶A连接酶（4-coumarate: coenzyme A ligase，4CL）是苯丙烷代谢途径中的3 个关键酶[29]。取样时间0 h对应果实损伤接种RD.006菌悬液（RD-FC组）和无菌水（FC组）之后的24 h。由图7A～C可知，RD-FC组中FcPAL、FcC4H、Fc4CL表达量分别在取样0 h呈现较高的表达量，可能是因为生防菌属于生物源激发子，可以诱导果实的抗性基因表达上升，取样0 h之后这3 个基因的表达量都出现不同程度的下降，之后在不同时间点又恢复上升趋势并在54 h左右达到峰值。FcPAL在FC组的最高表达量显著小于其在RD-FC组的最大表达量（P＜0.05），同时后期表达量峰值出现的时间滞后于RD-FC组，FcC4H和Fc4CL基因的表达结果与FcPAL相类似，说明生防菌RD.006处理可以诱导果实迅速发生抗病反应，并且在贮藏后期维持抗病相关基因FcPAL、FcC4H、Fc4CL更高的表达水平。

图7 贝莱斯芽孢杆菌RD.006对无花果果实FcPAL（A）、FcC4H（B）、Fc4CL（C）、FcAPX（D）、FcCAT（E）、FcPOD（F）基因表达的影响Fig.7 Effect of Bacillus velezensis RD.006 on the expression of the FcPAL (A), FcC4H (B), Fc4CL (C), FcAPX (D), FcCAT (E) and FcPOD (F) genes in fig

木质素等化合物的合成与植物抗病性密切相关，过氧化物酶（peroxidase，POD）参与木质素合成反应的最后一部分，即木质素单体氧化聚合反应，此反应需要H2O2的参与。抗坏血酸酶（aseorbate peroxidase，APX）和过氧化氢酶（catalase，CAT）可以协同清除细胞产生的H2O2，进而减少过氧化物对细胞的破坏。由图7D～E可知，取样0 h两组的FcAPX表达量无显著差异；在12 h时RD-FC组果实的FcAPX表达量迅速上调至最高值，而FC组的变化并不显著；在取样后期（36～72 h），RD-FC组FcAPX表达量显著小于FC组（P＜0.05）。FcCAT的表达结果与FcAPX表达模式相类似。这可能是因为RD.006的接种诱导了活性氧的爆发，促使植物细胞APX和CAT活性上升以清除产生的过氧化物。而FC组果实FcAPX、FcCAT在取样后期（36～72 h）的表达水平较高，促进APX和CAT的合成以清除H2O2等有害物质，这可能是因为FC.006侵染也会使果实细胞遭到破坏并产生大量H2O2、自由基等有害物质，激活了果实的抗病性，但这种抗病反应具有一定的滞后性。

由图7F可知，RD-FC组果实的FcPOD表达水平在取样0 h时显著提高，在取样前期（0～24 h）始终维持较高的表达水平，同时期果实组织的苯丙烷代谢途径中关键酶FcPAL、FcC4H、Fc4CL同样有较高的表达水平，因此推测RD.006的接种可以迅速激活果实的苯丙烷途径，增强寄主的抗病性，促使果实类黄酮、木质素等相关抗性代谢物的生成。

3 讨 论

炭疽菌（Colletotrichumsp.）是世界上侵染植物的十大致病性真菌之一[30]，炭疽病的病程较短，若不加以防控，一旦感染无花果，在短时间内果实便会发生不可控制的软烂。无花果炭疽病病原菌的鉴定是生物防治炭疽病的基础。目前，炭疽菌的分类主要依赖于形态学特征结合基因ITS进行鉴定，但炭疽菌的纯培养特征会因培养条件的不同而存在差异，而单一的ITS序列可能会存在一定的错误率，因此采用多基因序列对近亲缘关系的炭疽菌的研究更加可靠。李丹丹等[31]从安徽‘108B’无花果发病果实和叶子上分离得到病原菌株，并通过形态学和多基因（ITS、ACT、GAPDH、CAL、TUB2、CHS-1）鉴定为胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）；本实验从‘布兰瑞克’无花果病果上分离出菌株FC.006，采用多基因序列联合分析鉴定其属于胶孢刺盘孢复合种下的哈锐炭疽菌（C.horri），可见引起无花果炭疽病的病原菌种类与果实品种、地理位置、栽培等条件有关。

对植物病原菌具有良好拮抗效力的芽孢杆菌中，多数菌株可以通过分泌具有抑菌活性的代谢物质来达到抑菌的目的。有研究表明，贝莱斯芽孢杆菌可以分泌抗菌蛋白[32]、聚酮类化合物[33]、脂肽类抗生素[34]等抑菌物质。本实验中的离体平板对峙实验表明，贝莱斯芽孢杆菌RD.006能通过产生扩散性抑菌物质有效抑制哈锐炭疽菌FC.006菌丝的生长。

Priming机制是指植物组织被生物或非生物激发子处理后，植物显示出更强的防御能力[35]，被认为是植物中不同类型诱导抗性的共同机理。生防菌对寄主果实抗性的诱导主要是通过激活一系列生化防御反应及果实的免疫系统，同时能够促进伤口处结构性壁垒物质的积累，病原菌侵染时会发挥更强的组织抗病性。苯丙烷代谢途径是与植物抗病性密切相关的次级代谢途径，本实验结果显示，生防菌RD.006的预防接种会诱导无花果苯丙烷代谢途径关键酶相关基因的表达上调，表明RD.006会一定程度上激活苯丙烷代谢途径。该途径会产生酚类物质、类黄酮和木质素等物质，其中酚类物质和类黄酮对病原菌有直接的杀死作用，而木质素能提高细胞壁组织木质化的程度，从而提高对病原菌的抵御能力。Wang Xiaoli等[36]发现，与单独接种病原菌或生防菌的枇杷果实相比，两者同时接种的处理方式会诱导果实产生更高的PAL、POD、PPO等防御相关基因的表达水平，这种诱导作用是Priming机制介导的果实防御体系被激发的结果。本实验中同样发现，相较单独接种病原菌的果实，生防菌和病原菌都接种的果实FcPAL、FcC4H、Fc4CL、FcAPX、FcCAT、FcPOD基因在接种后有较高的表达水平，而只接种病原菌的果实6 个抗性基因的相对表达量在不同时间点也有较高的表达量，但最高值普遍小于生防菌和病原菌同时接种的处理组。佐长赓等[37]的研究同样表明，贝莱斯芽孢杆菌B.velezensisBG-2与病原菌协同参与诱导厚皮甜瓜CAT、POD、SOD等防御酶的激活。此外，从本实验结果中可以发现，在贮藏期间的部分时间点，只接种病原菌的FC处理组果实的6 个抗性基因表达量高于生防菌和病原菌都接种的RD-FC组果实，可能是FC.006的强致病作用对生防菌RD.006诱导果实组织的免疫响应具有一定的抑制作用。有研究同样表明，生防菌直立顶孢霉（Acremonium strictum）产生的枯草菌素类似蛋白AsES可以作为生物激发子诱导植物的防御反应，促进活性氧的积累，加强木质素、胼胝质等加强细胞壁支撑物质的生物合成，上调FaPR1、FaCHI23、FaPDF1.2、FaCAT、FaCDPK、FaCML39等抗性基因的表达，而病原菌隐秘刺盘孢（Colletotrichum acutatumM11）能够产生一种扩散化合物抑制AsES诱导的植物抗性响应[38]。

4 结 论

从无花果病果上分离出一株病原菌FC.006，通过形态学鉴定结果结合基于ITS、GAPDH、TUB、CHS、ACT、CAL多基因联合系统发育树分析鉴定为Colletotrichum horri，其能够引起无花果炭疽病的发生。在离体条件下贝莱斯芽孢杆菌RD.006可以直接抑制FC.006菌丝的生长，在培养8 d时的体外抑菌率达到85%，预防接种RD.006能够激活无花果果实的苯丙烷途径，诱导抗氧化相关基因表达迅速上升，RD.006可以作为一种生物激发子诱导果实抗性，有效防治无花果采后炭疽病害。后续研究可聚焦于RD.006抑菌活性代谢物质的鉴定，此外，苯丙烷代谢途径分子调控机制等还需深入研究。本研究结果可丰富无花果采后病原菌的种类，同时为采后病害的绿色防控提供理论基础。