基于网络药理学探析复方菝葜治疗非小细胞肺癌的机制*

朱立华，周融融，黄生武，何 丹，3，张海潮，3，谢 谊

（1.湖南国华制药有限公司，湖南 长沙 410013；2.湖南省中医药研究院，湖南 长沙 410013；3.湖南中医药大学研究生院，湖南 长沙 410208）

肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一，也是导致癌症相关死亡的主要原因，每年约有200万新发病例和176万死亡病例[1]。肺癌发病率在多数国家呈升高趋势，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的75%~85%。大多数NSCLC临床病例确诊时已属中晚期，失去了手术切除机会，而目前传统放疗、化疗效果欠佳，5年生存率仅为5%~10%[2]。因此寻找新的更有效的治疗方法显得尤为重要。

近年来，中药复方在控制肿瘤增殖、减毒增效、预防复发、延长生存期、改善生活质量等方面具有独特的优势。越来越多临床医生采取中西医结合的方法治疗肿瘤患者，如在西药化学治疗后，通过中药调理，延长生存期并改善生活质量。复方菝葜（Fufang Baqia，FFBQ）为国华制药有限公司自主研发，由菝葜、鱼腥草、猫爪草、土鳖虫、款冬花、枸杞子、大枣（去核）、鲜鳢鱼8味药材组成，具有清热解毒、软坚散结、滋阴益气、扶正培本之功，辅助治疗肺癌、子宫颈癌等多种癌症具有较好的疗效[3]。研究表明，复方菝葜能稳定肿瘤瘤体，抑制肿瘤生长，其治疗肺癌的临床有效稳定率达88.24%[4]。前期研究通过HPLC-Q-TOF-MS技术，从复方菝葜组方中分析得到29种化学成分，并对其物质基础进行了初步探索，然而复方菝葜组成药味较多、化合物构成复杂，且关于其抗NSCLC的药效物质基础及分子机制尚未探明，限制了复方菝葜进一步开发利用。网络药理学的应用提供了一种将中医整体理念与药物发现相结合的新模式，使复方研究实现了从“一靶、一药”模式转向“网络靶点、多组分治疗”模式。

本研究结合前期物质基础分析，通过成分数据库平台丰富复方菝葜成分数据库，采用网络药理学筛选并构建“药物-靶点-疾病”网络，挖掘和预测复方菝葜多成分、多靶点协同参与抗NSCLC的潜在物质基础、作用途径，旨在为其抗NSCLC的临床应用及开发提供参考和科学依据。

1 方 法

1.1 数据库及软件 （1）药材及化合物信息平台：PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；中国知网（https://www.cnki.net/）；中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP, http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）；2020年版《中华人民共和国药典》。（2）非小细胞肺癌数据平台：GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）；人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM，https://www.omim.org/）；DisGeNET数据库（A database of genedisease associations, http://www.disgenet.org）。（3）靶标预测平台：Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）。（4）化合物结构绘制软件：ChemDraw 14.0。（5）蛋白质标准化数据平台；UniProt数据库（http://www.rcsb.org）。（6）网络可视化平台及软件：STRING数据平台（https://string-db.org）；Cytoscape 3.7.1软件。（7）靶标GO功能及KEGG富集平台：DAVID平台（The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, https://david.ncifcrf.gov/）。

1.2 药材成分信息及靶标预测 依次检索复方菝葜中菝葜、鱼腥草、猫爪草、土鳖虫、款冬花、枸杞子、大枣、鲜鳢鱼8味药材，在2020年版《中华人民共和国药典》、TCMSP数据库、中国知网、PubChem中收集归纳各药材成分、归经及靶标信息。复方菝葜抗NSCLC的潜在候选成分需满足吸收、分布、代谢和排泄标准（Absorption，Distribution，Metabolism，Elimination；ADME）：即类药性（drug like, DL）≥0.18；口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%。针对数据库或文献中有活性而无直接关联靶标信息的成分，则按照如下步骤预测靶标：在PubChem数据库中检索成分的SMILES字符串或下载成分结构文件，将结果上传至Swiss Target Prediction平台进行靶标预测，其中排名前10的靶标被视为成分潜在靶标。

1.3 非小细胞肺癌靶标数据库 以“non-small cell lung cancer”为关键词在OMIM、GeneCards、DisGeNET3个疾病信息平台中检索NSCLC发生发展密切相关的蛋白靶标；采用Uniprot数据库对疾病靶标名称进行规范化。

1.4 GO和KEGG富集分析 将预测到的复方菝葜活性靶标与NSCLC相关靶标进行比对遴选，进一步得到复方菝葜成分与疾病的共调控靶标。通过DAVID在线平台对共有靶标进行GO功能注释和KEGG通路富集。分别采用靶标富集数量、通路富集P值进行排序和可视化。

1.5 网络构建及拓扑分析 通过Cytoscape 3.7.1软件对上述收集的药材成分、药材靶标、药材归经、疾病靶标进行关联与可视化，分别构建复方菝葜-归经网络、药材-活性成分-靶标网络、蛋白-蛋白互作网络（protein-protein interaction network,PPI）。采用Merge工具进行网络间的关联，并通过Network Analyzer统计各靶标的中介中心度（BetweennessCentrality，BC）和连接度值（Degree），对各节点（node）的网络中心度和重要度进行评价。

1.6 分子对接 为进一步验证网络预测结果，通过Autodocks 4.2.6软件对关键活性分子与关键靶标进行虚拟分子对接。从PDB（http://www.pdb.org）平台下载关键蛋白的3D结构，在PubChem数据库中收集关键活性分子（配体）的3D结构，采用Autodocks 4.2.6软件对蛋白和配体进行去水，加氢，加电荷等前处理。

2 结 果

2.1 复方菝葜-归经分析 以复方菝葜7味药材为关键词，从TCMIP、2020年版《中华人民共和国药典》及文献中收集并分析该方的归经信息，构建复方菝葜-归经网络。（见图1）依据连接度值（Degree）大小对归经网络的各脏腑重要度进行排序，依次为：肺经（degree=4）、肝经（degree=4）、肾经（degree=3）、胃经（degree=3）、脾经（degree=2）、心（degree=1）。结果表明，复方菝葜对机体肺经和肝经的选择性较高，其主要通过干预上述经络到达病位发挥治疗作用。

2.2 复方菝葜抗NSCLC的网络分析

2.2.1 复方菝葜“药材-活性成分-靶标”网络 从文献调研及数据库中共收集复方菝葜641个活性成分，依据ADME标准对各成分进行筛选和去重，共获得99个潜在活性成分（菝葜9个、鱼腥草5个、猫爪草10个、土鳖虫4个、款冬花16个、枸杞子35个、大枣20个）。基于上述活性成分共预测到313个潜在靶标。（见表1）通过Cytoscape软件中的Merge工具对药材-成分及成分-靶标信息进行综合关联，构建复方菝葜药材-活性成分-靶标网络。（见图2）复方菝葜的组方药材均表现出多成分调控多靶标的特性。槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（βsitosterol）、落新妇苷（astilbin）、花旗松素（taxifolin）、阿托品（atropine）、山奈酚（kaempferol）、7-O-甲基毛纲草酚（7-OMethyleriodictyol）、千金藤碱（stepholidine）、腺苷（adenosine）和光千金藤碱（stepharine）在网络分析中被选定为复方菝葜抗NSCLC的潜在关键性活性成分。上述成分在网络中呈现较高的Degreee值，可同时参与二十余个生物靶标的调控。结果表明，复方菝葜全方合用具有多成分、多靶标协同参与抗NSCLC的优势。

表1 复方菝葜“中药-化合物-活性成分-潜在靶标”信息

表2 复方菝葜有效成分信息

图2 复方菝葜“药材-活性成分-靶标”网络

2.2.2 蛋白-蛋白互作网络 为筛选复方菝葜抗NSCLC的潜在靶标，进一步构建复方菝葜成分与疾病的靶标蛋白互作网络，本研究以“non-small cell lung cancer”为关键词，在GeneCards、OMIM和DisGeNET 3个数据库平台分别检索到241、182和115个NSCLC相关靶标，设为疾病背景数据库。通过比对药材的313个潜在靶标，得到63个复方菝葜成分-疾病共有靶标（见图3），并将其视为GO、KEGG富集分析的候选靶标。采用STRING平台分析63个共有靶标间的生物关联，构建蛋白-蛋白互作网络（PPI）。（见图4）拓扑数据显示，Degree值排名前10的靶标依次为MYC、TP53、EGFR、AKT1、CTNNB1、CASP3、CCND1、ERBB2、GAPDH、HIF1A，其在PPI网络中的拓扑分数见表3。

表3 10 个核心靶标的信息

图3 复方菝葜成分-疾病共有靶标图

图4 PPI 网络筛选图

2.3 复方菝葜抗NSCLC的靶标及通路富集

2.3.1 GO富集 采用DAVID平台对复方菝葜治疗NSCLC的63个共有靶标进行GO功能富集，依据靶标富集数量排序，筛选到前30项GO功能富集条目。（见图5）结果显示，复方菝葜主要通过细胞核、细胞质、细胞外间隙、胞质溶胶、核质、胞外区、线粒体等细胞元件（Cellular component），参与RNA聚合酶Ⅱ启动子转录调控、凋亡过程调控、蛋白质磷酸化的正调控、细胞周期调控、信号转导、细胞增殖调控、对外源刺激的反应等生物学过程（Biological process），起到蛋白质结合、酶结合、蛋白激酶结合等分子功能（Molecular function），从而发挥抗NSCLC的功效。

图5 63 个共有靶标的GO 生物功能富集分析

图6 KEGG 通路富集分析

2.3.2 KEGG富集 通过KEGG注释63个共有靶标的富集通路，共得到34条与NSCLC发展或治疗相关的生物途径（P＜0.01）。（见表4）KEGG富集结果提示，复方菝葜治疗NSCLC的途径主要为多靶标协同调控多条生物通路。

表4 复方菝葜治疗NSCLC的34 条相关通路信息

2.4 分子对接 分子对接可以预测其结合模式的强弱，也就是结合能。两者之间结合能越小，说明配体与受体的构象越稳定，通常结合能＜-5 kcal/mol时，结合活性较好。因此，本研究选择自由度高的成分槲皮素、花旗松素和落新妇苷，与关键靶点MYC、TP53和EGFR进行分子对接。（见表5、图7）结果显示，复方菝葜的关键活性成分与治疗NSCLC的关键作用靶点具有较好的结合活性，但是其具体作用机制和相关靶点还有待于进一步验证。

表5 关键活性成分与关键靶点对接的结合能 （kcal/mol）

图7 分子对接的结果

3 讨 论

NSCLC的治疗及机制探索虽取得了重要进展，但其总体治愈率和生存率仍然较低。NSCLC仍是目前致死率最高的肺癌类型之一[5]。因此继续寻求新药或联合疗法，以将临床益处扩大到更广泛的患者群体，并改善NSCLC的预后是目前亟待解决的问题。复方菝葜联合诸药对于肺癌尤其是NSCLC中晚期，以及肺癌伴咳嗽、胸痛等症具有显著改善作用，但缺乏与之相关的机制探索[6-7]。网络药理学分析从中药整体性出发，可实现药物“多药味、多成分、多靶标、多途径”作用模式的可视化和系统化展示。近年来网络药理学被广泛应用于复杂中药的机制研究中，为阐明中药及其复方作用机制作用提供了新思路[8]。

复方菝葜-归经网络分析显示，肺经和肝经（degree=4）是该方各药味选择性较高的经络，提示复方菝葜作用的主要病位在于肺和肝。同时该方对肾、胃、脾、心经也有较好的富集。中医古籍并无NSCLC病名记载，现代中医学家依其特征将其归为“肺积”“肺岩”“肺萎”等范畴。病机为正气虚损，邪毒入肺，久则耗气伤阴，造成脾胃虚弱，肝胆疏泄不畅[3,9-10]。复方菝葜中菝葜、鱼腥草清热解毒；猫爪草、土鳖虫软坚散结；枸杞子、大枣、鳢鱼具有扶正祛邪之功；款冬花润肺下气；枸杞子滋补肝肾；大枣益气健脾，调和诸药[3]。复方菝葜全方合用，可能通过靶向多个经络，发挥扶正祛邪、提高脾胃运化和肝胆疏泄的作用。

复方菝葜“药材-活性成分-靶标”网络筛选得到10个潜在活性成分，包括1个四环三萜类化合物、3个生物碱类化合物、5个黄酮类化合物和1个腺苷。上述成分均可参与多个生物靶标的调节从而发挥治疗作用。研究显示，菝葜总黄酮提取物可通过调控p53介导的凋亡信号通路，激活人NSCLC细胞A549的凋亡[11]。落新妇苷是菝葜中含量较高的黄酮类成分，具有抗炎、抑制免疫、保肝护肾等药理活性[12]。其可通过上调Bax、cleaved-Caspase-3，下调Bcl-2蛋白表达来增强顺铂促进A549细胞凋亡的作用[13]。研究表明，槲皮素可通过介导PI3K/Akt、AMPK/mTOR、Stat3/Mcl-1和NF-κB等多条通路，促进NSCLC细胞凋亡，抑制癌细胞迁移与侵袭[14-16]。β-谷甾醇[17]、花旗松素[18-19]、山奈酚[20]和腺苷[21]均可显著降低NSCLC细胞的增殖、侵袭与迁移能力。千金藤碱能抑制A549细胞血红素加氧酶-1（heme oxy-genase-1, HO-1）和表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）的基因表达，发挥抗癌细胞增殖作用[22]。这些化合物可能是复方菝葜治疗NSCLC的潜在物质基础，也提示复方菝葜具有多成分、多靶标协同参与抗NSCLC的作用。这些化合物共同发挥增强抗炎、抗癌细胞增殖等作用来达到治疗NSCLC的功效，但是其药效成分和机制还有待进一步研究。KEGG通路富集结果显示，MAPK、PI3K-Akt和JAK-STAT信号通路（node·15）可能是复方菝葜治疗NSCLC网络中的关键信号通路。研究表明，上述通路作为细胞内重要信号转导途径，能通过影响下游众多效应分子的活化状态，控制肿瘤的发生发展，包括细胞凋亡、转录、翻译、代谢、血管新生及细胞周期的调控[23-25]。下调JAK/STAT或PI3K/Akt被证实可抑制NSCLC细胞的增殖和迁移[26-27]。这为后续基于信号通路从分子生物水平研究复方菝葜治疗NSCLC提供了方向。

综上所述，复方菝葜中槲皮素、花旗松素、落新妇苷、山奈酚、腺苷、千金藤碱和光千金藤碱等核心成分，可能通过MYC、TP53、EGFR、AKT1 和CTNNB1 等 关 键 靶 点 及MAPK、PI3K-Akt、JAK-STAT、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性、TNF等信号通路来控制NSCLC的发生发展。复方菝葜可通过“多成分、多靶标、多途径”协同治疗NSCLC，为复方菝葜后续治疗NSCLC的临床应用及开发利用提供了参考和依据。