胶体金免疫层析技术在农药残留检测中的应用

梁才英

（钦州市钦北区那蒙镇农业农村服务中心，广西钦州 535000）

农药能够有针对性地预防、控制并消除病虫草，主要应用于农业、林业、牧业以及渔业等产业中，保障植物、动物的生长与繁殖，对于提高产量有着非常重要的作用。我国关于农药的使用有着十分完善的管理制度，但仍旧无法完全规避农药滥用、泛用等问题，不仅对生态环境造成了较大的破坏，也威胁着人们的生命健康。常见的农药残留检测方法主要包括大型仪器检测和免疫检测，虽然前者检测结果的准确率较高，但操作复杂、检测周期较长且花费较高，不适用于流通时间较短的果蔬。胶体金免疫层析技术属于后者，1971 年首次出现，主要是利用胶体金作为示踪标志物，以纤维层析材料为固相反应界面，利用抗原抗体的特异性结合原理，在毛细作用下观察样品溶液中胶体金产物的定向流动[1-2]， 操作便捷且检测快速，除了应用于农药残留检测之外，还广泛应用于疾病诊断、食品检测、重金属等环境污染物的检测中，检测效果理想。

1 胶体金免疫层析技术的应用原理及特点

1.1 原理

胶体金也被称为氯金酸水溶液，与白磷和柠檬酸三钠结合能够在还原反应、聚合反应作用下形成一种大小基本相等的颗粒物质，此类颗粒物质在受到静电作用时还会反应形成一种胶体溶液[3]。其电子密度极高、稳定性极强，如果颗粒物质的聚集密度超过规定阈值，其表面还会形成面积较大的红色斑点，便于肉眼或仪器观察，检验人员只需要观察被检测物质中的红色斑点数量便可以得出结果，因此，如果将胶体金作为免疫层析检测中的指示物，则能够以膜为载体，完成对特殊抗原或抗体的固定，继而实现毛细作用下被测物质在层析试条上的持续运动[4]。此外，需要注意的是，不同还原剂所产生的颗粒是不同的，在检测过程中会呈现出不同的特点，而胶体金能够满足不同物质的检测需要，并能最大限度确保检测结果准确。

1.2 特点

胶体金免疫层析技术操作简单且具有较高的灵敏度，主要呈现出以下特点：①该检测技术的检测范围较广，除了能够检测出食品等被测物质中的农药残留，还能检测出微生物、真菌霉素等，甚至可以同步检测出被测物质是否含有违禁药品；②该检测技术的检测方法十分便捷，只需要简单处理样品后肉眼观察即可，不需要借助设备或仪器便能保证检测结果的准确性，因此不要求检测人员具有高超的知识与专业技能；③相比于传统的酶标记、放射性同位素以及荧光素等检测技术，该检测技术所使用的试剂安全性更高，既能够保证检测环境无污染，还能避免对检测人员的身体造成伤害；④当前市面上流通的胶体金免疫层析检测卡灵敏度为1 ng·mL-1，相比于其他检测方法具有更高的灵敏度，这是因为该检测技术只需要标记单克隆抗体，同时对其有特异性、亲和性的只有抗原决定簇[5]；⑤该检测技术所使用的试条具有较为稳定的化学性质，主要是胶体金吸附被测物质中的蛋白质进行吸附并标记，且不会影响到蛋白质活性，同时兼具质量小的特点，便于检测人员随身携带并随时展开现场检测工作。

2 胶体金免疫层析技术在农药残留检测中的应用——以克百威为例

2.1 克百威介绍

克百威是一种高效杀虫剂，属于氨基甲酸酯类，应用于蔬菜、粮食、水果等农作物中能够有效防治害虫，应用时会将其直接喷洒在农作物根部，待根系吸收后随着水分传送至叶子、茎部，实现内吸杀虫的效果。但是，克百威具有较高的毒性，一旦暴露在空气中，很长时间都不会消散，不仅无法在酸性土壤中降解，会污染土壤和地下水，还会威胁到周边鸟类及水生动植物的安全。如果在农作物上大量使用克百威，便会形成农药残留。相关研究发现，克百威会影响到γ-谷氨酰转移酶的血清活性，严重的还会导致肝脏的充血性坏死。大鼠实验结果表明克百威有着较为显著的肝毒性作用与致突变性，如果食品中残留有克百威，则会严重危及人们的生命健康[6]。

2.2 胶体金免疫层析技术检测克百威的具体方法

2.2.1 胶体金单克隆抗体偶联物的制作

在胶体金悬浮液中加入0.2 mol·L-1的碳酸钾溶 液，一边搅拌一边加入抗体溶液直至溶液的酸碱度达到8.2、浓度达到2 μg·mL-1，将溶液温育30 min后加入1%浓度的牛血清白蛋白溶液，持续搅拌 20 min 以确保胶体金的稳定性。将得到的溶液混合物在4 ℃环境中作离心处理，时间大约为15 min，结束后再用1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液进行溶液沉淀，通常需要洗涤3 次，沉淀后将沉淀物放入含有1%牛血清白蛋白和0.05%叠氮化钠的磷酸盐缓冲溶液中，将其保存于4 ℃的环境中备用。整个过程需要特别注意溶液酸碱度的检测，且将备好的胶体金抗体偶联物用在试纸条的准备中则能够检测出其性能。

2.2.2 胶体金试纸条的组装

目前市面上常见的试纸条包括硝酸纤维素膜、共轭垫、吸收垫和样品垫。当克百威样品溶液被加入到样品垫时，在层析作用力下会定向流动至吸收垫，此时样品溶液中的抗原便会与共轭垫上的胶体金标记结合，而后继续移动，与对照线上的抗原、抗体结合，此时由于胶体金标记无法与测试线包被抗原结合，测试线上的颜色越浅，样本溶液中的抗原浓度就越高。利用点样仪（型号为BioDot Quanti3000）在硝酸纤维素膜上加入山羊抗小鼠IgG 作为对照线，加入3-琥珀酰-克百威-OVA 作为测试线，再用点样仪将备好的胶体金单克隆抗体偶联物固定到共轭垫上，组装好胶体金条与外壳则完成试条的组装，将其保存于4 ℃的环境中。胶体金试纸条的最小浓度以测试线完全不可见为标准，当试纸条中加入克百威样品，则测试线的颜色通常比对照线的颜色浅，如果在试纸条中加入空白溶液，则测试线与对照线的颜色相同，如果加入溶液后没有出现对照线，则表示样品无效[7]。

2.2.3 标准曲线的建立

胶体金试纸的检测限就是使测试线完全不可见的最小浓度，因此将一系列梯度稀释的标准溶液浓度加入试纸条中，即0 ng·mL-1、0.25 ng·mL-1、 0.50 ng·mL-1、1.00 ng·mL-1、2.50 ng·mL-1、5.00 ng·mL-1、10.00 ng·mL-1和20.00 ng·mL-1，当胶体金测试线相比对照线明显较弱时，得到克百威的最低检出浓度为1 ng·mL-1。

2.3 检测结论分析

本次研究中利用胶体金分别检测了不同浓度的克百威试纸条，结果显示胶体金对克百威的最低检出浓度为1 ng·mL-1，而根据调查，如果隐形添加的克百威浓度超过2%，稀释1 000 倍后的克百威含量仍不低于20 mg·L-1，所以应用胶体金免疫层析技术能够检测出市面上绝大多数物品中的克百威浓度超标问题。另外，本次测试没有特别使用缓冲液或纯净水，只需要用自来水将被测物质进行稀释便可直接检测，不需要采用特定的纯净水或缓冲液，便于现场实时快速检测，更加适用于稀释条件不高的环境，可以简单快速地检测出被测物品中是否有克百威农药残留。

3 胶体金免疫层析技术在农药残留检测中的应用发展趋势

胶体金免疫层析技术最早应用于医学领域，近几年随着我国对食品安全问题的重视，才逐渐延伸至安全质量检测领域，如农药残留检测等。利用胶体金作为单一常规标记材料，可直观显示被测物质中的农药残留。在未来，科技的进步使得大量新型材料相继问世，纳米磁珠、镧系稀土、荧光微球等新型材料均可作为标记材料代替胶体金[8-9]。技术的革新要求相关研究人员不断提升专业知识与技能储备，充分利用多种标记材料以实现检测结果的进一步优化。总的来说，胶体金免疫层析技术在农药残留检测中的应用发展趋势主要是实现标记材料的不断升级。只有实现标记材料的升级优化，才能不断提升检测灵敏度与检测效率，提高检测的准确性与可靠性。

当前胶体金层析免疫技术在食品农药残留检测中的应用效果良好。胶体金免疫层析技术可以快速、准确地检测出被测物质中的农药残留，操作简单且准确率高，试纸条也便于携带，能够在现场实时完成检测工作，其检测原理主要是识别抗体、抗原或半抗原之间的特异性反应，是一种以此为基础所建立的生物化学分析方法，但是在检测之外，检测人员还需要对被测物质进行简单的前期处理。在农药残留检测中，部分被测物质的前期处理工作十分烦琐，且每一次检测都需要使用一个试纸条，导致检测成本增加。因此，胶体金免疫层析技术的未来发展方向要着重于高通量试纸条或检测卡的研究，以不断减少成本。

另外，在以往传统的胶体金免疫层析技术检测中通常只能检测出一种农药残留，且属于定性检测，或者对被测物质中的某种农药残留进行半定量检测。如果被测物质中的农药残留量超过胶体金试纸条所能检测出的最大限量，则无法准确定量地检测出实际残留。对此，相关研究人员不断优化检测试纸条与检测方法，以期能够不断扩大定量精度、检测范围，结果发现将单一颜色的检测线进行多条组合，然后将其置于同一层析膜上，则能够大大提升胶体金试纸条的检测效果，对单一农药残留的定性或对多种类农药残留的定量分析，在节省检测时间的同时还能为检测人员提供更多的关联信息。需要注意的是，样品垫与检测线之间的距离越大，被测溶液层析后到达检测线的时间就越长，加上无法避免多条检测线之间相互干扰，因此检测结果无法达到预期[10]。若要实现胶体金层析技术在多种农药残留中的检测效果，仅在单层析膜上添加多条检测线是不够的。应用多条检测线的胶体金免疫层析技术进行检测，除了需要考虑到灵敏度、特异性、产品稳定性等常规量之外，还应当充分考虑到多条检测线之间的距离，被测物质层析速度以及检测时的浸提液使用量等，不断优化试纸条材质，以逐步提高检测线的显示清晰度和均匀度，最大限度保障检测结果的准确可靠。

4 结语

综上所述，在进行农药残留检测时，相比于需要利用大型仪器的气相色谱、液相色谱等检测技术，胶体金免疫层析技术操作更加简单，所获得的检测结果也准确可靠，更加适用于快速筛查果蔬等物质中的农药残留。胶体金免疫层析技术仅仅是免疫检测方法中的一种。已经有研究表明，多种方式联合检测能够进一步提高检测准确率，因此在未来，免疫层析的多组分检测方法将成为一种主流应用趋势，农药残留检测技术的选择依据则会趋向于减少检测成本，并同步满足被测物质中多种农药的同时检测需求。