木薯种子休眠特性及破除方法研究

郭长林 宋记明 骆凯 唐丽 符秀梅 陈银华 张瑞

关键词：木薯；種子休眠特性；萌发；休眠破除

木薯（ManihotesculentaCrantz）为大戟科（Euphorbiaceae）木薯属植物，是世界三大薯类作物、全球第六大粮食作物之一，素有“地下粮仓”“淀粉之王”和“特用作物”之誉称，为全世界近6亿人提供粮食保障[1-4]。我国于19世纪20年代对木薯进行引种栽培，现已广泛种植于广西、广东和海南等华南8省（区），种植面积约30.47万hm2。随着我国经济的发展以及对生物能源需求的快速增长，木薯作为我国燃料乙醇原料的非粮能源首选作物，已成为我国绿色能源发展战略的新焦点[5]。

杂交育种是木薯种质改良和品种选育的重要手段之一，可以保证后代遗传的多样性。然而，木薯种子存在种子萌发率低、发芽时间长、出苗率低等问题，严重影响木薯杂交后代优良性状的表达，极大地限制了木薯新品种的选育[4，6]。针对木薯种子萌发困难的问题，前人开展了一系列研究。MUMFORD等[7]研究发现，当含水量为1.9%～5.9%的木薯种子经室内贮藏6个月后，萌发率由80%下降至28%，故认为木薯种子属于顽拗型种子，但这一论断很快被否定。EILLS等[8-9]研究证明木薯种子属于正常型种子，即种子含水量处于6%～8%时，在5℃条件下安全贮藏7a，种子生活力未发生明显变化。MARIN等[10]将含水量为6.1%的木薯种子密封保存在-20℃条件下，种子生活力在14a间基本保持不变，进一步证实了该观点。后续研究表明，木薯种子存在休眠是导致其不萌发的主要原因，且研究多集中在休眠破除方法上，如MARTIN[11]和NARTEY[12]研究发现，机械破除、层积、硫酸处理、常温或热水浸泡均不能显著提高木薯种子的发芽率。而PUJOL等[13]研究表明高温干燥处理后木薯种子萌发率为55%；韦本辉等[14]发现经低温干燥贮藏或浸泡处理后木薯种子萌发率达20%～60%；此外，ddH2O和600mg/LGA3浸泡36h后，华南5号木薯种子萌发率由25%分别提高至40%和75%[6]；划破处理+冷热循环2次处理后，木薯种子萌发率达64%[15]。综上，以往研究对木薯种子休眠最佳破除方法尚无一致看法。

针对木薯种子存在休眠这一关键问题，一方面可以通过研发高效快捷的种子休眠破除技术来解决，另一方面，可通过选育低休眠率的种质来实现，而明确木薯种子休眠特性是开展以上2种解决途径的关键和前提。不同于水稻、小麦、玉米等种子繁殖型的作物，木薯在生产上通常采用茎秆繁殖，且常规育种目标主要聚焦于薯块产量和品质方面，尚未针对低休眠率特性研究以指导品种选育。因此，在明确木薯种子休眠特性的基础上探究高效安全的休眠破除方法，是解决木薯种子萌发率低，提高杂交木薯育种进程的重要途径。基于此，本研究以华南124号母本自然结实种子为材料，通过种子形态结构观察、吸水率测定以及萌发试验对木薯种子休眠特性及休眠破除方法进行探究，以期为木薯在生产实践中的应用推广提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

供试木薯种子（华南124号母本自然结实种子）于2022年2月采自国家木薯产业体系保山综合试验站示范基地西双版纳州勐海县布朗山乡（21°58′N，99°58′E，1261m），该地区年均温为18～21℃，年均降水量为1374mm。在木薯蒴果成熟裂开前，用透气网袋（20cm×20cm）将其固定。待其自然开裂后带回实验室清选，获得足量木薯种子。室温干燥后装入牛皮纸袋中，置于4℃冰箱贮藏备用。

1.2方法

1.2.1种子形态指标测定随机数取30粒饱满的木薯种子，使用游标卡尺测量种子长、宽、高，取平均值，设置3次重复。随后，参照TANG等[16]的方法，将木薯种子经固定、脱水、干燥及导电处理后，使用扫描电子显微镜（HITACHIRegulus8100，Japan）分别对木薯种子的表面和横切面进行显微结构观测，并采集图片。

1.2.2种子百粒重测定从饱满种子中随机选取100粒种子，用万分之一电子天平进行称重，重复8次。

1.2.3种子生活力测定随机选取25粒种子，4次重复。用温水（30℃）浸泡24h，剥去种皮后置于培养皿中，加入足量0.5%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液使种子完全浸没，随后将其置于30℃恒温培养箱避光培养12h，参考国际种子检验规程[17]，将去种皮的种子纵切1/2露出胚，立即观察种胚着色的情况，最后计算种子生活力。

1.2.4种子吸水率和吸水曲线测定选取未处理（CK）、去种阜和砂纸打磨发芽口处理的木薯种子各25粒作为1个重复，共设置4个重复，分别在30℃条件下浸泡于盛有50mL蒸馏水的培养皿（直径11cm）中分别浸泡0、4、8、12、24、36、48、60、72、84、96h后取出，用吸水纸吸干种子表面水分，迅速称重。当出现种子胚根突破种皮时，吸水试验停止[18]。

种子吸水率=（种子吸水后重量-种子初始重量）/种子初始重量×100%。

1.2.5不同休眠破除方法处理木薯种子在不同休眠破除方法处理前，选取足量的木薯种子用10%的NaClO溶液浸泡1min，蒸馏水冲洗3～4次，室温置于滤纸上晾干后立即使用。

（1）机械处理。a.去种阜。用镊子固定种子后去除种阜（种阜部位如图1所示）。b.划破种皮。用砂纸打磨木薯外种皮（侧部），直至露出白色内种皮时停止。c.砂纸打磨发芽口。用砂纸轻拭发芽口，直至露出白色内种皮时停止。d.去种皮。用钳子轻微用力夹破种皮，尽量不划伤种胚和胚乳，再用解剖刀缓慢剥除。

（2）湿热处理。将种子置于50mL离心管后加满蒸馏水，封口膜密封，放入80℃的热水中分别浸种0（CK）、5、10min。

（3）冷热循环处理。将未经处理的种子和砂纸打磨发芽口的种子分别放入50mL离心管中，加满蒸馏水，封口膜密封，以冰水静置2h，随后放入30℃的温水2h作为1次循环，共进行2次循环。

（4）赤霉素浸种处理。分别将种子浸泡在0（CK）、100、200mg/LGA3溶液中，35℃水浴8h。

（5）硝酸钾浸种处理。分别将种子置于0（CK）、2%和4%硝酸钾（KNO3）溶液中，35℃水浴8h。

1.2.6种子萌发试验（1）不同休眠破除方法对木薯种子萌发的影响。采用纸上萌发法，将1.2.5处理后的木薯种子置于培养皿中，在光照培养箱35℃（12h光/12h暗）条件下进行培养，以未处理的木薯种子为对照。每处理25粒种子，4次重复。以胚根突破种皮作为判断种子萌发的标准，逐日统计各处理的萌发种子数，持续统计14d[19-20]。

萌发率（germinationpercentage，GP）=供试种子中萌发的种子数/供试种子数×100%

萌发指数（germinationindex，GI）=ΣGt/Dt式中，Gt为萌发试验终期内每日萌发数；Dt为萌发日数；Σ为总和。

（2）休眠破除后木薯种子萌发对温度的响应。选取适量最佳休眠破除方法处理后（砂纸打磨发芽口）的木薯种子，分别将其置于25、30、35、40℃（12h光/12h暗）条件下进行培养，每处理25粒，4次重复。种子萌发统计标准及萌发指标测定同1.2.6-（1）。

1.3数据处理

采用SPSS26.0统计软件进行数据分析，采用Duncans检验对不同处理的平均值进行多重比较，采用Excel2021软件制作图表。

2结果与分析

2.1木薯种子形态

新收获的木薯种子呈卵圆形，其种皮、胚乳和胚部分如图1所示。种皮包括外种皮、内种皮和种阜；外种皮硬壳质，表面光滑，有黑色和褐色斑纹，种脊与种子长轴平行，位于种子腹侧中央，种阜位于种子一端呈膨大的浅棕色隆起物；内种皮半透明膜质，与外种皮相连不易分开。胚乳呈白色，光滑饱满占种子体积绝大部分。胚由子叶、胚芽、胚轴及胚根组成，与胚乳在空间上分离。经测定，供试木薯种子长、宽、高分别为（10.17±0.13）、（5.94±0.08）、（3.74±0.05）mm，种子千粒重为（89.79±5.41）g，种子生活力为94.00%±2.40%。

显微观察结果显示，木薯种子外表皮整体光滑（图2A），多见大小不一的圆形小洞呈线性排在种脊处（图2B），其余部位有些许裂缝。木薯种子种阜膨大呈海绵状隆起（图2C），表面皱缩（图2D），中部有一个呈“Y”字型的种阜管道。扫描电镜下，木薯种子子叶中部横切面展示，胚乳占种子体积的大部分，以不同厚度包裹着种胚，胚乳外侧依次由内种皮和外种皮包裹（图2E），其中种子外种皮各部分结构基本相似，由外至内依次为表皮层、海绵组织层和栅栏组织，且栅栏层细胞排列较为致密（图2F）。

2.2种阜与种皮对木薯种子吸水率的影响

分别对去种阜、砂纸打磨发芽口和未处理种子进行吸水率测定（图3）。结果显示，木薯种子吸水率在0～24h内均快速增加，浸泡24h后，未处理种子和去种阜种子的吸水率开始缓慢提升，随后逐渐趋于平稳，而砂纸打磨发芽口木薯种子在24h左右已开始萌发。3种处理的木薯种子在吸水24h的吸水率分别为：CK（36.5%）>砂纸打磨发芽口（32.4%）>去种阜（24.0%），说明种阜与种皮并不影响木薯种子吸水，但对种子吸水率有一定影响。对照组吸水率大于砂纸打磨发芽口和去种阜处理，是由于种阜是海绵状的隆起物，其本身可吸收大量水分。

2.3不同休眠破除方法对木薯种子萌发的影响

2.3.1机械处理对木薯种子萌发的影响通过不同机械处理方法对木薯种子休眠破除的研究，结果表明，35℃培养14d后，木薯种子萌发率表现为砂纸打磨发芽口（88%）>去种皮（69%）>划破种皮（29%）>去种阜（12%），均显著高于CK（2%）（P<0.05），其中砂纸打磨发芽口（36.6）和去种皮（22.6）处理后木薯种子萌发指数显著高于其他处理（P<0.05），而去种阜（1.9）和划破种皮（4.4）处理后木薯种子萌发指数与CK组无显著差异（图4）。去种皮处理后木薯种子萌发率和萌发指数显著低于砂纸打磨发芽口处理，可能是由于在去除种皮的过程中易导致种胚损伤，加之去种皮处理相比砂纸打磨发芽口操作更为繁琐。由此可见，种皮可能是导致木薯种子休眠或抑制种子萌发的关键因子，而砂纸打磨发芽口可直接减少胚根伸出的阻力，从而提高木薯种子萌发率和萌发指数。

2.3.2湿热处理对木薯种子萌发的影响湿热处理能够通过改变种皮结构或透性影响种子萌发，采用不同时间湿热处理（80℃）对木薯种子休眠破除进行探究，结果如图5所示，相比CK组，5min和10min湿热处理能显著提高木薯种子萌发率（19%和16%）和萌发指数（3.6和2.6），萌发率分别提高8.5倍和7.0倍，萌发指数分别提高3.5倍和2.5倍。而10min湿热处理后，木薯种子萌发率和萌发指数略低于5min湿热处理，说明湿热处理提高木薯种子萌发的效果因处理时间而异，需控制好湿热处理的时间。

2.3.3冷热循环处理对木薯种子萌發的影响冷热循环处理引起种子休眠破除的主要原因是由于温度的急剧变化引起种皮开裂，从而导致种皮透性增加。从图6可知，未处理的种子和砂纸打磨发芽口后的种子经冷热循环处理后，种子萌发率和萌发指数均显著提高，其中砂纸打磨发芽口+冷热循环2次处理后，木薯种子萌发率和萌发指数分别达58%和24.3，显著高于CK+冷热循环两次处理后的（25%和4.6）（P<0.05），说明冷热循环对引起种皮透性改变的程度不如机械处理更直接有效。

2.3.4赤霉素浸种处理对木薯种子萌发的影响由图7可知，与CK相比，不同浓度赤霉素浸种处理后，木薯种子萌发率和萌发指数无显著差异，0（CK）、100、200mmol/LGA3浸种8h处理后种子萌发率分别为2%、1%和2%，萌发指数分别为0.9、0.2和0.5（图7）。可能是由于木薯种皮较为致密（图2），赤霉素虽促进胚生长能力，但仍不足以突破种皮的机械障碍，导致其促进萌发作用不显著。

2.3.5硝酸钾浸种处理对木薯种子萌发的影响硝酸钾（KNO3）通过加速细胞代谢、提高营养物质或增强种子内部酶活性打破植物种子休眠，促进萌发。通过不同浓度硝酸钾浸种处理对木薯种子萌发的影响，结果发现4%KNO3浸种8h能一定程度提高木薯种子的萌发率和萌发指数，与CK相比，萌发率由2%提高至9%，萌发指数由0.1提高至1.8（图8）。但是，整体效果不佳，可能的原因，一方面是由于KNO3浓度偏低，更可能是因为木薯种皮栅栏层结构致密，KNO3不易进入种子内部，导致其不能发挥作用。

2.3.6综合比较根据上述不同休眠破除方法效果的比较，可看出砂纸打磨发芽口、砂纸打磨发芽口+冷热循环、湿热处理5min和4%KNO3处理后，木薯种子萌发率和萌发指数均显著高于CK，其中砂纸打磨发芽口处理效果最佳，其次为砂纸打磨发芽口+冷热循环处理，而湿热处理5min和4%KNO3处理效果不理想（图9），进一步说明种皮是影响种子木薯种子萌发的关键因素，机械处理砂纸打磨发芽口处理效果佳，而湿热处理可通过增加种皮的通透性，一定程度提高木薯种子萌发率。

2.4休眠破除后木薯种子萌发对温度的响应

最佳休眠破除方法处理后的木薯种子，萌发率和萌发指数随温度的升高呈先增加后减小的趋势，其中30℃和35℃条件下，木薯种子萌发率分别为84%和88%，显著（P<0.05）高于25℃和40℃条件下的51%和0。种子萌发指数则表现为35℃（36.6）>30℃（36.0）>25℃（14.0）>40℃（0），35℃条件下种子萌发指数显著高于其他温度条件下，即萌发速度最快（图10），表明35℃是休眠破除后木薯种子萌发的最适温度。

3讨论

3.1木薯种子的休眠机制

种子休眠是指具生活力的种子在适宜环境条件下一定时长不能萌发的现象[21]。BASKIN等[22]在NIKOLAEVA[23]对种子休眠划分类型的基础上，将种子休眠划分为物理休眠（PY）、生理休眠（PD）、形态休眠（MD）、形态生理休眠（MPD）和复合休眠（PY+PD）。吸水试验结果表明，新收获的木薯种子能够吸水，排除物理休眠和复合休眠；通过对新收获木薯种子形态结构观测，发现木薯种子成熟时种胚是发育完全的，即排除形态休眠和形态生理休眠，最终判定木薯种子存在生理休眠，即由于种胚生长势不足导致其无法顺利穿过种胚包被物而引起的休眠。

BASKIN等[21]提出引起种子生理休眠的原因主要有以下几种：（1）种子胚包被物通过减缓吸水、阻碍气体交换或存在抑制物等阻碍种子萌发；（2）种子胚包被物的机械阻碍等；（3）种子胚包被物阻碍内部抑制物质的排出等。本研究结果表明，种阜与种皮虽减缓了木薯种子吸水速率，但并不阻碍种子本身吸水或影响种子萌发的最终吸水量，因此排除第一种可能原因。木薯种子去除种阜后，最终萌发率与对照无显著差异（P>0.05），表明种阜不是抑制种子萌发或引起种子休眠的原因。郭学民等[24]对同为大戟科的蓖麻（Ricinuscommunis）种子进行显微结构观察，结果发现，蓖麻种子的发芽口并未被种阜所覆盖，说明种阜不存在诱导生理休眠的可能。木薯种子经冷热循环和湿热处理后，萌发率均显著高于CK，究其原因可能是由于冷热循环和湿热处理增加种皮的通透性，不仅能够减弱种皮的机械阻碍作用，还有利于萌发抑制物的渗出[25-27]。通过显微结构观察，发现木薯种子种皮栅栏层细胞排列较为致密，可能是引起木薯种子吸水缓慢和阻碍胚根伸出的原因所在。此外，本研究中砂纸打磨发芽口和去种皮处理后的木薯种子萌发率显著高于其他处理，也进一步验证了这一观点。综上所述，种皮的机械阻碍作用及内源抑制物质的存在是引起木薯种子休眠的主要原因，而具体抑制物质的种类及其所在部位尚需进一步探究。

3.2木薯种子的休眠破除方法

根据NIKOLAEVA[28]休眠划分体系，由胚包被物机械阻碍引起的休眠属于机械休眠，由萌发抑制物存在引起的休眠属于化学休眠，其实质均属于BASKIN等[22]休眠划分体系中的生理休眠类型，其表现形式为胚生长势不足，使胚根不易突破种皮束缚。对于此种休眠类型，通常采用机械处理如去种皮、划破种皮、砂纸打磨种皮等，化学处理如KNO3、NaOH、浓硫酸等，激素处理如赤霉素（GA3）等，浸种处理、层积处理等方法进行种子休眠破除[21，29-32]。研究表明，种皮的机械障碍和种皮内源抑制物存在是皇后帝王花（Proteamanifica）种子休眠的可能原因，30min酸蚀（98%浓硫酸）处理可有效打破其种子休眠[20]。郑广进等[33]研究发现，不同浓度的HCl、NaOH、KNO3及赤霉素（GA3）处理均不能有效打破龙爪茅（Dactylocteniumaegyptium）种子休眠，是由于种皮的完整性阻碍了KNO3和GA3进入种胚，而摩擦种皮处理后低浓度的KNO3及GA3处理后萌发率显著提高，因而其休眠主要是由种皮对种胚的束缚引起的机械阻碍造成的。与本研究结果类似，砂纸打磨发芽口处理后，木薯种子萌发率达88%，萌发速率最快（萌发指数达31），其破除休眠效果均优于其他处理如KNO3和GA3浸种处理，是目前已报道最为有效的休眠破除方法。韦祖生等[6]研究表明ddH2O和600mg/LGA3浸泡36h后，华南5号木薯种子萌发率由25%分别提高至40%和75%，显著高于本研究中蒸馏水和GA3浸种处理，其原因可能是：（1）二者所选用木薯种质不同，其种皮结构或化学成分存在差异；（2）可能是由于浸种时间存在差异。NWAKO等[15]研究结果表明划破处理+冷热循环2次处理后，木薯种子萌发率达64%，与本研究中砂纸打磨发芽口+冷热循环处理结果基本一致，但均显著低于本研究中砂纸打磨发芽口处理，可能是由于砂纸打磨发芽口处理时种皮被不同程度破坏，如若继续进行冷热循环处理容易造成种胚损伤。去种皮处理后的木薯种子萌发率显著低于砂纸打磨发芽口处理，可能也是由于在去种皮的过程中，易造成木薯种子胚或胚乳部分损伤，从而导致部分种子腐烂或死亡。此外，相比对照组，湿热处理和冷热循环能够显著提高木薯种子萌发率，是由于湿热处理能够通过改变种皮透性进而促进种子萌发，与布海丽且姆·阿卜杜热合曼等[34]对准噶尔无叶豆（Eremospartonsongoricum）、银沙槐（Ammodendronbifolium）和乌拉尔甘草（Glycyrrhizauralensis）的研究一致，冷热循环处理则是由于温度的急剧变化使种皮既膨胀又收缩改变其透性，进而促进种子萌发，与TANG等[16]对含羞草（Mimosapudica）种子的研究结果一致。与本研究结果相似，上述4种植物种子种皮结构均较为致密，胚根不足以突破种皮的束缚进而萌发。

3.3木薯种子萌发对温度的需求

种子萌发是种子植物生命周期最为关键的阶段，易受温度、光照、水分、盐分、pH、埋深等多种环境因子综合影响[21]。许多研究表明，温度作为种子萌发最关键的环境信号之一，通过影响种子内部相關酶活性和物质代谢控制种子萌发，温度过高或过低均不利于种子萌发[35]。一般来说，种子萌发随温度的升高呈先增加后减小的趋势，种子萌发的三基点温度（最低温、最适温和最高温）也证实了这一观点[36-37]。本研究结果表明，木薯种子萌发率和萌发指数在25～40℃范围内，呈先增加后减小的趋势，与曹敏等[38]对热带牧草崖州硬皮豆（Macrotylomauniflorum‘Yazhou）的研究结果一致。木薯种子萌发最佳温度为35℃，此温度条件下萌发率最高且萌发速度最快，与梁振华等[39]对木薯种子的研究结果基本相似，35℃恒温条件下，种子萌发最早，发芽速率最快。此外，本研究发现当木薯种子置于40℃温度条件下培养时，由于萌发温度过高，导致其胚根突破种皮时腐烂进而发霉死亡。因此，35℃可作为木薯种子繁育的最佳育苗温度。

综上所述，木薯种子存在生理休眠，种皮的机械阻碍作用及种子内部抑制物质的存在是引起木薯种子休眠的主要原因。砂纸打磨发芽口可有效破除木薯种子休眠，休眠解除后的种子在35℃条件下萌发率最高、萌发速度最快。因此，在实际生产过程中，将木薯种子采用砂纸打磨发芽口处理后在35℃条件下育苗，有利于其后期成功建植，但在操作的过程中，应注意打磨力度，避免因伤害到胚根而影响种子萌发进而形成不正常苗甚至死亡。