缺锌胁迫下玉米叶片出现类似细胞凋亡现象

王盛锋，汪 洪

（1 农业农村部植物营养与肥料重点开放实验室 / 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081；2 农业农村部作物专用肥料重点实验室 / 新洋丰农业科技股份有限公司，北京 100070）

石灰性土壤锌供应不足较普遍[1-2]。植物缺锌往往表现为叶片脉间失绿，枯萎黄化等症状，组织与细胞水平上观察发现，缺锌叶片出现局部区域细胞死亡，呈现“坏死”性斑点和斑区[2-3]；叶肉细胞收缩、变小，细胞间隙增大[4-5]；缺锌水稻叶片细胞线粒体和叶绿体结构变形[6]；缺锌玉米叶片细胞体积变小、细胞膜皱缩，严重缺锌时，细胞内容物消失、细胞死亡[7]。

细胞死亡根据生理特点，可分为两种类型：一类是病理性死亡，即通常所指的坏死，是指当细胞遭到强烈的有害刺激时，出现被动、突发性的非生理性死亡，主要表现为细胞胀大，细胞膜破裂，内容物外溢流失等形态特征，这类死亡不受基因调控，细胞核变化较慢，DNA 降解不充分[8-9]；另外一类称为细胞程序性死亡，是积极、主动的细胞消亡过程，由特定基因编码，以DNA 早期降解为特征的生理性细胞死亡[10-12]。根据形态与生化特征的差异，细胞程序性死亡又可细分为细胞凋亡、自噬性细胞死亡和程序性细胞坏死[13-14]。自噬性细胞死亡过程中大量自噬小泡产生，自噬小泡与溶酶体融合，降解包裹于其中的底物[13-14]。植物细胞凋亡的特征表现为细胞萎缩，细胞骨架破坏，细胞质和细胞核边缘化；后期DNA 断裂，被具膜小泡包裹，形成凋亡小体，但细胞膜结构完整，无内容物渗出。凋亡细胞生物化学的特征表现为核酸内切酶活性增加，导致DNA 发生特异性降解，形成180～200 bp 或其整数倍的片段，凝胶电泳产生梯状条带，称为DNA 梯状条带 (DNA ladder)。DNA 断裂过程中，产生3′-OH 末端，被末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端原位标记法 (TUNEL)标记，呈现亮绿色荧光特征标记[10-12]。另外，细胞凋亡受特定基因调控，需要特定基因表达和蛋白质合成，植物中发现了类Caspase活性的蛋白酶，如Metacaspase 和VPE (vacuolar processing enzyme)，介导细胞凋亡[12,15-16]。

动物锌营养不足，体内活性氧增多激活p53基因，凋亡蛋白酶Caspase 基因表达上调，Caspase 酶活性增强，细胞内DNA 受损，出现明显的细胞凋亡特征，补充锌素营养可改善抑制细胞凋亡[17-19]。番茄原生质体和小叶出现细胞凋亡时，Zn2+离子抑制而Ca2+离子增强DNA ladder 强度[20]。挪威云杉胚胎发育过程中，细胞内锌离子稳态与细胞凋亡关系密切：胚胎细胞中锌的分布决定细胞命运，细胞内锌离子浓度降低，导致胚胎细胞死亡，加锌抑制类凋亡蛋白酶活性，抑制胚柄细胞分化与胚胎发育[21]。由此，我们推断植物锌素营养供应不足，可能会导致细胞出现凋亡。

本研究选择对缺锌敏感玉米为试验作物，观察了缺锌玉米叶片细胞结构，细胞DNA ladder 强度，叶片细胞DNA 降解特征，测定了凋亡蛋白酶Caspase活性，拟揭示缺锌玉米叶片细胞是否出现凋亡特征。

1 材料与方法

1.1 植株培养

供试玉米品种为‘农大108’和‘郑单958’，选取饱满一致的种子经10% H2O2消毒15 min，去离子水洗净后，浸泡12 h，转移到铺有湿滤纸的培养皿中，上盖一层湿纱布，25℃黑暗中催芽1 天。选择发芽一致的种子播于洗净的石英砂中，室温下育苗。7 天后 (两叶一心)，选择长势一致的幼苗，去掉胚乳，移栽到500 mL 玻璃培养管中进行营养液培养。玻璃培养管直径为5 cm，高20 cm，外用黑色塑料布包裹遮光。幼苗培养在人工气候箱进行，控制条件为光照时间 12 h，光照强度24000 lx，昼夜温度为25℃/20℃，相对湿度70%。

基础营养液配方 (mmol/L) 为：Ca(NO3)22.0、K2SO40.75、MgSO40.65、KH2PO40.25、EDTA-Fe(Ⅱ)0.1、H3BO31.0×10-3、MnSO41.0×10-3、CuSO41.0×10-4、(NH4)Mo7O245.0×10-6。设置不加锌(0µmol/L)和正常供锌(1 µmol/L) 两个处理，代号分别为-Zn 和+Zn，1 个玻璃管中种植1 株苗，代表1 次重复，每个处理4 次重复。营养液每隔2 天更换1 次，更换时营养液pH 用NaOH 或HCl 调到6.2，锌以ZnSO4·7H2O 供给。

1.2 测定项目

1.2.1 生物量 处理20 天后，收获植株样品，分开地上部和根系，用直尺测量株高和根长，称量鲜重，去离子水洗净，擦干，105℃下杀青1 h，80℃下烘干至恒重，测干物质重。

1.2.2 植株锌含量 1.2.1 中样品经烘干粉碎后，经HNO3-HClO4(3∶1)消煮，用原子吸收分光光度计 (型号为WFX-120C，北京瑞利分析仪器公司)测定锌浓度，计算植株锌含量和锌积累量。

1.2.3 叶片细胞结构观察 处理10、15 和20 天时，选择完全展开新叶，取缺锌处理玉米叶片中出现缺锌症状的部位和加锌处理玉米叶片的相对应部位，保存在甲醛-乙酸-乙醇(FAA)溶液固定。经不同浓度的酒精 (30%、50%、60%、70% 酒精各1 次/15 min，80%、90%、95%酒精各1 次/20 min，100% 酒精7～8 次/h)脱水、二甲苯 (1/5、2/5、3/5、4/5 各1 次/5 min，纯氯仿2 次/5 min)透明后，用石蜡浸透、包埋。轮转式切片机 (型号为KD 2508，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)进行石蜡切片，切片厚度10 µm，展片后经二甲苯脱蜡，苏木素—伊红染色，于光学显微镜 (型号为XD-101，南京江南永新光学有限公司)下观察叶片解剖结构。

1.2.4 细胞超微结构观察 处理10、15 和20 天时，选择完全展开新叶，取缺锌处理玉米叶片中出现缺锌症状的部位和加锌处理玉米叶片的相对应部位，固定在2.5%戊二醛固定液中，经pH 7.2 磷酸缓冲液反复冲洗，置于1%锇酸固定2 h 以上，经梯度酒精 (30%、50%、60%、70%酒精各1 次/15 min，80%、90%、95% 各1 次/20 min，100% 酒精7～8 次/h)脱水，纯丙酮冲洗后，环氧树脂渗透包埋。用超薄切片机(型号为UC6／FC6，Leica) 超薄切片，厚度80 nm，切片用镍网捞起，醋酸铅—双氧铀染色，在透射电镜 (型号为HITACH7500)下观察细胞超微结构，CCD 相机 (型号为GATAN832)拍照。透射电镜加速电压80 kV。

1.2.5 DNA 琼脂糖凝胶电泳 分别取处理5、10、15、20 天完全展开新叶，液氮研磨，于2 mL 离心管中加入700 µL 十二烷基硫酸钠溶液，65℃下温浴30～60 min，再加等体积酚∶氯仿 (1∶1)，轻摇至分层，12000×g下离心10 min。吸取600 µL 上清液到1.5 mL 离心管中，加入450 µL 预冷异丙醇，待出现沉淀后，12000×g下离心10 min，弃去上清液，用500 µL 70%酒精冲洗，弃上清，自然干燥一夜；加200 µL Tris-EDTA buffer 缓冲液溶解DNA。吸2 µL DNA 溶解液与1 µL 缓冲液Loading Buffer，上样，用0.8%琼脂糖凝胶电泳，经溴化乙锭溶液染色后，利用凝胶成像系统 (chemiDoc Universal Hood Ⅱ, 美国BIORAD)观察拍照。

1.2.6 DAPI 荧光染色观察 采集处理10、15、20 天玉米完全展开新叶，参考张旭红等[22]方法，经3:1 配比的甲醇+冰醋酸固定3 h，去离子水冲洗干净后，放入2%纤维素酶和果胶酶混合液中，于28℃下保温3 h，超纯水冲洗，软化叶片样品取出，置于预冷载玻片上，展开，干燥；再用0.1% pH 7.4 的Triton-X 磷酸缓冲液处理3 次，每次5 min，1 µg/mL DAPI 染色，50%甘油封片，于荧光显微镜 (型号为IBE2003，重庆光学仪器厂)下观察拍照。激发波长358 nm，发射波长460 nm。

1.2.7 Caspase-3 酶活性检测 Caspase-3 酶的提取与检测采用碧云天生物技术研究所检测试剂盒。分别取处理10、15、20 天的完全展开新叶100 mg 左右，加入液氮研磨，后加入1 mL 提取液和300 µL 裂解液，冰浴3 h，轻轻振荡，20000 g 下保持4℃离心15 min，上清液转到预冷离心管中，-70℃下保存。

按检测缓冲液与裂解液9∶1 的比例配置2 mL稀释液，将10 mmol/L 的pNA (p-nitroaniline)进行稀释，配置6 个浓度pNA 标准品序列：0、10、20、50、100 和200 µmol/L；取200 µL 待测液，于405 nm 波长处用光谱扫描多功能读数仪 (型号为Varioskan Flash，Thermo Scientific 公司)测定吸光度，制作吸光度与pNA 浓度之间的标准曲线。

取出pNA 和底物Ac-DEVD-pNA (acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide, 2 mmol/L)，冰浴备用。配置样品反应体系：80 µL 检测缓冲液、10 µL 待测样品和10 µL Ac-DEVD-pNA，90 µL 检测缓冲液+10µL Ac-DEVD-pNA 为空白对照，于37℃下孵育2 h，用光谱扫描多功能读数仪测定吸光度，与标准曲线对比，计算催化产生的pNA 量。单位时间内与1 nmol 底物Ac-DEVD-pNA 反应产生1 nmol pNA 为Caspase-3 的酶活性单位。考马斯亮蓝法测定样品中蛋白浓度，以单位质量蛋白质为基础计算Caspase 3 酶活性。

1.3 数据统计及分析

对数据进行方差统计分析 (ANOVA)，采用Duncan新复极差方法检验不同处理之间数据的显著性差异(P＜0.05 为差异显著)。

2 结果与分析

2.1 缺锌处理18 天的植株生长及缺锌症状

缺锌培养10 天后，植株新叶出现轻微黄化；第15 天时，新叶基部白化，呈透明状，植株矮小，节间缩短；第18 天时，叶片枯萎，基部坏死。农大108 出现缺锌症状比郑单958 早1～2 天，但缺锌后期郑单958 出现的症状更为严重 (图1)。

图1 缺锌处理18 天的玉米幼苗及缺锌症状Fig.1 Growth and Zn deficient symptoms of maize cultivar Nongda 108 and Zhengdan 958 at 18 days of -Zn treatment

根系生长发育受到缺锌影响，颜色变深，长度明显缩短。2 个品种比较，缺锌对农大108 根系形态影响较对郑单958 更大 (图2)。

图2 缺锌处理18 天玉米根系生长状况Fig.2 Roots of maize cultivar Nongda 108 and Zhengdan 958 at 18 days of -Zn treatment

2.2 缺锌处理20 天的植株生物量

缺锌胁迫20 天后，2 个品种玉米地上部和根系鲜重明显下降，地上部干物质重下降显著，但根系干物质重尚未受到明显影响，植株根冠比增大 (表1)。

表1 不同锌处理下玉米生物量 (g/plant)Table 1 Fresh and dry biomass of maize plants under normal and deficiency of Zn

2.3 缺锌处理20 天的植株锌含量

缺锌玉米地上部和根系中锌含量明显降低，地上部锌含量≤10 μg/g；根系锌含量高于地上部，正常供锌处理的地上部锌积累量高于根系 (表2)。

表2 缺锌和正常供锌处理植株锌含量和锌积累量Table 2 Zn concentration and accumulation of maize plants under normal and deficiency of Zn

2.4 光学显微镜观察下的叶片显微结构

缺锌培养10 天，两个品种玉米叶片显微结构尚未受到明显影响。15 天时，叶片细胞收缩、叶绿体数目减少。20 天时，叶绿体明显减少，叶片细胞变小，细胞间隙增大 (图3)。两个品种比较，前期农大108 比郑单958 叶片显微结构破坏较重，叶绿体数目下降更多，后期郑单958 受损较大。

图3 缺锌(-Zn)和供锌(+Zn)处理10、15 和20 天的农大108 和郑单958 叶片横切结构 (Bar=50 µm)Fig.3 Leaf transversal section image of maize cultivar Nongda 108 and Zhengdan 958 at 10, 15 and 20 days of -Zn and +Zn treatments (Bar=50 µm)

2.5 透射电子显微镜下观察叶片细胞核超微结构

2.5.1 农大108 与正常供锌处理相比，缺锌培养10 和15 天时叶肉细胞核膜收缩，细胞核不呈圆形、形状不规则，核内染色质浓缩，分布边聚化，趋于核膜侧 (图4)。缺锌胁迫下，维管束鞘细胞核结构造成破坏，20 天时，核膜收缩，核形状由近圆形变得不规则，皱缩呈扁平状。核内染色质减少但分布均匀 (图4)。

图4 缺锌(-Zn)和供锌(+Zn)处理10、15 和20 天的玉米品种农大108 叶肉细胞和维管束鞘细胞超微结构Fig.4 Ultra-structure of nucleus in leaf mesophyll and bundle sheath cells of maize cultivar Nongda 108 at 10, 15 and 20 days of -Zn and +Zn treatments

2.5.2 郑单958 与正常供锌处理相比，缺锌培养下，叶肉细胞核形状正常。随缺锌处理时间延长，细胞核内染色质减少、凝集、趋于边缘化 (图5)。与正常供锌相比，缺锌培养下的维管束鞘细胞核核膜收缩，外形不规则呈锯齿状，核内染色质较少，分布均匀 (图5)。

图5 缺锌(-Zn)和供锌(+Zn)处理10、15 和20 天的玉米品种郑单958 叶肉细胞和维管束鞘细胞超微结构Fig.5 Ultra-structure of nucleus in leaf mesophyll and bundle sheath cells of maize cultivar Zhengdan 958 at 10, 15 and 20 days of -Zn and +Zn treatments

2.6 DNA 凝胶电泳

细胞凋亡最显著的生化特征是琼脂糖凝胶电泳可见特征性的DNA ladder，是由于DNA 降解为大约由180～200 bp 或其多聚体组成的寡核苷酸片段所呈现的现象。

培养5 和10 天时，2 个品种叶片DNA 琼脂糖凝胶电泳结果在缺锌和供锌处理之间没有明显区别，但15 天时，可见明显的拖尾条带，表明此时叶片中DNA 可能发生了降解，郑单958 和农大108 表现一致 (图6)。

图6 缺锌胁迫不同时期农大108 (左)和郑单958 (右)叶片DNA 凝胶电泳图Fig.6 Images of agarose gel electrophoresis of DNA extracted from leaves of maize cultivar Nongda 108 (left) and Zhengdan 958 (right) at different time of Zn deficient stress

2.7 DAPI 染色观察

DAPI 是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，和双链DNA 结合后可以产生比DAPI 自身更强的荧光。缺锌培养10 天后，细胞核形状仍保持规则，成圆球形；但15 天后，缺锌处理样品的DAPI 染色荧光强度增加，细胞核碎片增多，部分细胞核不规则、弥散，体积增大，而供锌处理细胞核呈规则圆球状；20 天时，缺锌处理样品的荧光强度明显增强，核破碎，核碎片明显增多 (图7 和图8)。两个品种比较，农大108 缺锌细胞核受损程度较郑单958严重。

图7 缺锌(-Zn)和供锌(+Zn)处理10、15、20 天的玉米品种农大108 叶片原生质体DAPI 染色图Fig.7 DAPI stained protoplasts of maize cultivar Nongda 108 leaves at the 10, 15, and 20 days of -Zn and +Zn treatments

图8 缺锌(-Zn)和供锌(+Zn)处理培养10、15 和20 天的郑单958 叶片原生质体DAPI 染色图Fig.8 DAPI stained protoplasts of maize cultivar Zhengdan 958 leaves at the 10, 15, and 20 days of -Zn and +Zn treatments

2.8 Caspase-3 酶活性

表3 结果表明，培养10 天时，2 个品种玉米叶片Caspase-3 酶活性在缺锌和正常供锌处理间无明显差异。培养15 天后，缺锌郑单958 叶片中Caspase酶活性表现出升高趋势。培养20 天，缺锌处理的农大108 叶片中Caspase 3 酶活性显著增加。

表3 缺锌(-Zn)和供锌(+Zn)处理不同天数玉米叶片Caspase-3 活性 (pNA μmol/mg，protein)Table 3 The activity of caspase-3 in leaves of maize at different days of -Zn and +Zn treatments

3 讨论

细胞凋亡是由特定基因编码，以DNA 早期降解为特征的一种积极、主动的细胞消亡过程，这种过程在形态上表现为细胞萎缩、核固缩、染色质凝集、细胞形成“凋亡小体”，但其膜结构完整，无内含物渗出[9-12]。利用电子显微镜观察叶片细胞超微结构，我们发现，缺锌玉米叶肉细胞核膜出现皱缩，核内染色质凝集固缩，趋向核膜边缘，向外周聚集；维管束鞘细胞细胞核萎缩、变形、呈不规则状；缺锌玉米叶片细胞结构的变化呈现一定的细胞凋亡的形态学特征。但本试验尚未发现核膜出芽现象和“凋亡小体”的出现。植物细胞有细胞壁的阻隔，不易像动物细胞那样能产生凸出于细胞之外的凋亡小体[9,23]。

植物细胞凋亡另一个特点是DNA 特异性降解，形成180～200 bp 或其整数倍片断，并产生大量3′-OH 末端[9-12]。DNA ladder 的形成是判断细胞凋亡发生的一个重要的典型的指标。本试验发现，缺锌培养15 天的玉米叶片中DNA 电泳呈现明显的拖尾条带，缺锌导致玉米叶片细胞中DNA 发生了降解。

DNA 断裂时，暴露的3′-OH 可以在末端脱氧核苷酸转移酶 (terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)的催化下加上绿色荧光探针荧光素 (FITC)标记的dUTP (fluorescein-dUTP)，即常用的TUNEL 检测[24]。我们TUNEL 试验结果并不理想 (结果未在此文中报道)，可能受到玉米叶片细胞壁和叶绿素荧光的干扰。DAPI 可对DNA 染色，在嵌入双链DNA 后释放蓝色荧光，通过荧光显微镜进行检测，同时观察到细胞核形态的变化[23,25]。张旭红等[22]用DAPI 荧光染色方法研究Cd 胁迫下蚕豆叶片细胞，发现随Cd 浓度增加，原生质体中细胞核相继出现染色体凝集、染色体凝集加剧趋边化、凋亡小体形成等过程。本试验通过DAPI 染色荧光显微镜观察发现，缺锌胁迫初期，叶片细胞的细胞核形状规则，成圆球形；但随着缺锌胁迫时间延长，DAPI 染色的荧光强度升高，细胞核碎裂成大小不等的圆形小体增多，弥散，体积增大。据此可以认为缺锌胁迫的玉米叶片细胞呈现出一定的类似细胞凋亡的生理生化特征。沈嵘等[26]研究表明，一定浓度锌可缓解有高盐胁迫或缓解紫外线诱导的水稻根尖原生质体细胞程序死亡。

植物体内参与细胞凋亡过程的核酸内切酶有DNase，协助完成细胞核清除，降解核DNA。依据对活性离子的依赖性，核酸内切酶可分为Zn2+依赖型、Ca2+依赖型、Mg2+依赖型及Ca2+和Mg2+同时依赖型4 类[27-28]。小麦糊粉层内存在受赤霉素诱导产生的DNase，中性环境下，受Ca2+和Mg2+激活但被Zn2+离子强烈抑制[29]。锌是转录因子如锌指蛋白和DNA/RNA 聚合酶活性所必需的离子，从而影响染色质结构以及DNA 的复制和RNA 的转录[3]。锌是RNA 聚合酶的金属元素组分，该酶保护核糖RNA 免受核糖核酸酶RNase 的攻击而降解。缺锌条件下，植物体内RNase 酶活性升高[3]。

半胱氨酸蛋白酶Caspase 被称为细胞凋亡效应器或核心酶。该酶具有半胱氨酸和天冬氨酸裂解位点，通过水解天冬氨酸残基C 末端的肽键 (P1 残基)，分解细胞内相关底物蛋白，引起细胞凋亡级联反应，导致细胞结构和代谢改变[23,30]。高温处理诱导番茄表皮细胞DEVDase (类Caspase-3)蛋白酶活性增加[31]。添加Ac-DEVD-CHO (Caspase-3 抑制剂) 可阻止DNA 断裂和PARP [poly-(ADP-ribose) polymerase]降解，从而抑制细胞凋亡[31-32]。本试验研究结果表明，培养20 天后，缺锌农大108 叶片中Caspase 3 酶活性显著升高，而郑单958 叶片中Caspase 酶活性在15 天缺锌处理时表现出升高趋势。在挪威云杉胚胎发育过程中，细胞内锌离子稳态与细胞凋亡关系密切，胚胎细胞中锌的分布决定细胞命运，细胞内锌离子水平耗竭，胚胎细胞出现死亡，添加锌离子，会通过抑制胚柄细胞分化而抑制胚胎发育，锌影响胚胎中类凋亡蛋白酶类Caspase 酶的活性[29]。锌与植物体内活性氧代谢之间关系十分密切[3]，活性氧参与调控植物细胞凋亡，可能的一条途径就是线粒体释放产生细胞色素C，细胞色素C 扰乱电子传递链，导致活性氧产生，激活类Caspase 活性及相关凋亡级联反应[25]。

4 结论

苗期短时缺锌，玉米叶肉细胞体积变小，收缩，叶绿体数量减少。叶肉细胞核膜出现皱缩，核内染色质凝集固缩，形成周边化特征；维管束鞘细胞核变形、萎缩；细胞核DNA 碎片增加，叶片中介导细胞凋亡的Caspase-3 酶活性升高，由此初步证实，缺锌胁迫导致玉米叶片细胞出现了类似细胞凋亡的形态与生理学特征。但缺锌植株体内凋亡信号的传递与相互作用、蛋白水解酶 (Caspases)活性关联反应等还需进一步研究。