HPLC-UV 法同时测定胡萝卜中5 种有机酸的含量

◎ 吕文超，周春红，沈莹萍，杨 阳，段筱筠，令宾强，马芮萍

（甘肃省产品质量监督检验研究院，甘肃 兰州 730050)

胡萝卜（Daucus carotavar.sativaHoffm.），属伞形科胡萝卜属胡萝卜种的一年生或二年生双子叶草本植物，亦称红萝卜、金笋或甘荀，在全球范围内种植面积很广。胡萝卜属于根菜类蔬菜，生熟皆可食用，含有多种维生素、氨基酸、微量元素等，其性平、味甘，具有保护呼吸道等的上皮细胞组织的功能，降低慢性疾病的发生率和增强人体免疫力，预防肺癌、强心、降压等功效，因此也称胡萝卜为“土人参”[1-3]。

有机酸是植物的重要组成成分，常用的检测方法有离子色谱法[4-5]、气相色谱法[6]、毛细管电泳法[7]、液相色谱法[8]等。气相色谱法上机分析测试前需要进行衍生化处理，操作烦琐，重现性较差；毛细管电泳法速度较快、成本低，但相比于液相色谱法，精密度和灵敏度较差[9-10]。液相色谱法由于操作简单、准确度高、精密度好而广泛应用于食品中有机酸的测定。

目前对胡萝卜的研究主要集中在不同工艺、不同种植方式对胡萝卜品质的影响方面，而对其有机酸的含量的研究较少。本研究旨在建立胡萝卜中5 种有机酸的液相色谱检测方法，为加强胡萝卜的质控及后续的产业化发展提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

U3000 高效液相色谱仪及二极管阵列检测器，赛默飞世尔公司；C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），北京迪马科技有限公司；TLE204E 分析天平（精密度为0.000 1 g），梅特勒公司；MS3D 涡旋振荡器，IKA 公司；KQ-600DE 台式数控超声清洗器，科桥超声波设备有限公司。

酒石酸（CAS：133-37-9）、苹果酸（CAS：6915-15-7）、乳酸（CAS：50-21-5）、柠檬酸（CAS：77-92-9）、丁二酸（CAS：110-15-6）标准品，酒石酸、苹果酸纯度均≥99%，柠檬酸、乳酸、丁二酸浓度为100 μg·mL-1，购于天津阿尔塔科技有限公司；甲醇、甲酸均为色谱纯，sigma 公司；其他试剂均为色谱纯。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液配制

标准储备液（100 μg·mL-1）：准确称取10 mg 标准品，加入甲醇使其溶解并用甲醇定容至10 mL。

混合标准溶液的配制（10 μg·mL-1）：将标准储备液逐级稀释至10 μg·mL-1。

1.2.2 样品前处理

参考马芮萍等[11]的方法，根据实验要求略有修改：称取粉碎试样2.0 g（精确至0.000 1 g）置于50 mL离心管中，加入20 mL 70%乙醇水溶液，充分匀浆1 min，40 ℃超 声 提 取30 min，4 000 r·min-1离 心5 min，将上清液转移至50 mL 容量瓶中，在残渣中加入20 mL 70%乙醇水溶液复提一次，合并上清液，用70%乙醇水溶液定容后过0.22 μm 滤膜，待上HPLC 测定。

1.2.3 仪器条件

色谱条件。色谱柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：25 ℃；流速1.0 mL·min-1；进样量10 μL，检测波长210 nm；流动相：甲醇-0.1%甲酸水。

1.2.4 方法学验证

参考傅志丰等[10]的方法，从线性关系、检出限、定量限、精密度、回收率等方面验证方法的可行性。

（1）线性关系、相关系数及检出限。将1.2.1 配制好的系列标准工作液按照色谱条件进样测定，以对照品浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y）做标准曲线，得到5 种有机酸的线性方程、相关系数。以信噪比（S/N）约为3、信噪比（S/N）约为10 得到各成分的检出限（LOD）、定量限（LOQ）。

（2）精密度和加标回收实验。精密称取胡萝卜样品1 共6 份，加入适量混合标准溶液，采用1.2.2 进行处理，按照色谱条件进样测定，计算添加水平的加标回收率和相对标准偏差（n=6）。

2 结果与分析

2.1 5 种有机酸检测方法的建立

将一定浓度的5 种有机酸的混合标准物质溶液在波长190 ～400 nm 的波段下进行紫外扫描，结果如图1所示。由图1 可知，酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、丁二酸在210 nm 附近均有较大吸收，结合参考文献及国家标准选择5 种有机酸的检测波长为210 nm。

图1 5 种有机酸在190 ～400 nm 波段的扫描图

依据色谱条件进行实验，采用HPLC 法得到的5 种有机酸混合标准物质的色谱图如图2 所示。由图2可知，5 种有机酸在10 min 内具有较好的分离度。

图2 5 种有机酸标准物质的HPLC 图

2.2 方法学考查

2.2.1 线性关系考查

将系列标准物质依次进样，以峰面积为纵坐标，以待测物浓度为横坐标，绘制得到标准曲线，5 种有机酸的线性关系见表1。由表1 可知，在10 ～200 ng·mL-1，5 种有机酸的响应线性关系良好，相关系数均≥0.999 12，检出限（S/N=3）在0.015 8 ～0.060 7 g·kg-1，定量限（S/N=10）在0.052 6 ～0.202 4 g·kg-1。

表1 5 种有机酸的线性关系考察表

2.2.2 回收率和精密度

在胡萝卜样品1 中添加有机酸标准溶液，加标水平做6 次平行实验，回收率及精密度结果见表2。由表2 可知，5 种有机酸的回收率范围为85%～115%，RSD 范围为0.46%～3.20%。方法的准确性较好，可用于蔬菜中有机酸的测定。

表2 5 种有机酸的加标回收率和相对标准偏差表（n=6）

2.3 样品含量测定

采用建立的方法分别测定了胡萝卜样品6 份，结果如表3 所示。由表3 可知，6 份胡萝卜样品中均含有5 种有机酸，酒石酸含量在0.020 5 ～0.405 0 g·kg-1，苹 果 酸 含 量 在0.009 3 ～2.265 9 g·kg-1，乳 酸 含 量在0.034 1 ～2.493 9 g·kg-1，柠檬酸含量在0.012 5 ～2.901 1 g·kg-1，丁二酸含量在0.062 1 ～1.214 8 g·kg-1。该方法可准确地测定胡萝卜中的酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、丁二酸。

表3 胡萝卜中5 种有机酸的含量表 单位：g·kg-1

3 结论

本研究建立了HPLC-UV 法同时测定胡萝卜中5 种有机酸的方法，其在10 ～200 ng·mL-1，相关系数r2均≥0.999，线性关系良好，检出限在0.015 8 ～0.060 7 g·kg-1，定量限在0.052 6 ～0.202 4 g·kg-1，回收率范围为85%～115%，RSD 范围为0.46%～3.20%。该方法的准确性较好，操作较简单，可用于胡萝卜中5 种有机酸的测定。