牛CART基因核心启动子鉴定及转录调控分析

王栋梁,任 静,郝琴琴,李鹏飞*

(1.朔州职业技术学院,朔州 036002;2.山西农业大学生命科学学院,太谷 030801)

牛在发情周期内通常只有一个卵泡能够发育成熟并排卵受精,绝大多数卵泡会在发育过程中走向闭锁,过度的卵泡闭锁严重制约着胚胎工程的应用及优良种畜扩繁[1]。可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocaine and amphetamine regulated transcript peptide, CART)是下丘脑分泌的内源性神经肽,参与调控摄食、药物成瘾及激素分泌等多种生物过程[2-4]。研究表明,CART是牛卵泡发育过程中的关键调控因子[5],体外培养牛卵泡颗粒细胞(granulosa cells, GCs)发现,添加CART可显著抑制促卵泡素(follicle-stimulating hormone, FSH)诱导的GCs中雌激素(estrogen, E2)的分泌,GCs中芳构化酶CYP19A1 mRNA表达量减少,因此认为CART在牛卵泡发育过程中发挥负调控作用[6]。

真核生物的基因表达极为复杂,可大致分为转录水平调控和转录后水平调控,其中细胞在转录水平对基因的表达调控最为经济有效,转录水平调控依赖基因启动子和特异性转录因子的相互作用。Shobatake等[7]报道,人CART启动子区域存在转录因子GATA2、GATA3结合位点,进一步研究表明干扰上述两个转录因子表达能够消除由间歇性缺氧诱导的CARTmRNA水平上调。Zhang等[8]发现,人CART启动子和内含子中均含有1个NRSF结合位点(NRSE),转录因子NRSF通过招募共阻遏复合物抑制CART表达,且NRSF对内含子NRSE的亲和力高于启动子NRSE。有研究发现,给予可卡因刺激后,大鼠伏隔核中CART和转录因子CREB含量增加,ChIP试验证明CREB直接与CART启动子区域结合激活转录[9-10]。本课题组前期致力于筛选并鉴定位于牛卵泡GCs膜上的能够与CART特异性结合并发挥调控作用的G蛋白偶联受体[11-12],而目前对于牛CART转录因子鉴定及其转录调控机制的研究也鲜有报道。

本研究利用PCR扩增、生物信息学分析、双荧光素酶报告基因试验对牛CART基因核心启动子区进行分析与鉴定;DNA pull down筛选能够与CART基因核心启动子区特异性结合的转录因子,并通过体外试验分析转录因子对牛CART基因核心启动子转录活性的影响,为进一步完善牛下丘脑CART基因表达调控网络,分析并阐明CART基因调控卵泡发育的作用机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验样品

山西文水县肉牛屠宰场选择3头正常发情的健康西门塔尔母牛,采集下丘脑组织后,投入灭菌DPBS中洗涤后液氮速冻,带回实验室处理。

1.2 试验试剂

人胚胎肾上皮细胞(293T)由山西农业大学生命科学学院实验室保存;组织基因组DNA提取试剂盒(天根);2×TaqPCR Master Mix(中科瑞泰);限制性内切酶KpnI、SmaI,TB Green® Premix ExTaqTMII(TaKaRa);pGL3-Basic载体、pRL-TK载体(Promega);pcDNA3.1(+)载体(Invitrogen);TransIntroTMEL(全式金);DNA pull down(伯信)。

1.3 试验方法

1.3.1 启动子序列结构分析 从NCBI GenBank数据库中获取牛CART(GenBank登录号:NM_001007820)基因组DNA序列,选取转录起始位点(transcription start site, TSS)上、下游启动子区域1 222 bp作为研究对象,利用EMBOSS数据库(https://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/)、MethPrimer数据库(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)预测启动子区内潜在的CpG岛位置;利用New PLACE数据库(https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)分析启动子上顺式作用元件位点。

1.3.2 基因组DNA提取 根据组织基因组DNA提取试剂盒说明书从牛下丘脑组织中抽提DNA,Nanodrop超微量核酸蛋白测定仪检测浓度及纯度后,置于-20 ℃暂存备用。

1.3.3 引物设计、PCR扩增及测序 利用Primer Premier 5.0针对CART启动子区设计特异性引物,交由公司合成,引物详细信息见表1。

1.3.4 重组载体构建及双荧光素酶活性检测 根据顺式作用元件位点对启动子序列5′端进行截短,具体截短长度及位置见图1,在截短片段上、下游分别引入KpnI和SmaI酶切位点,交由上海吉玛制药技术有限公司合成。利用限制性内切酶KpnI和SmaI对pGL3-Basic质粒进行双酶切,酶切产物经T4DNA连接酶连接后转化感受态细胞,选取阳性重组质粒测序,重组质粒分别命名为pGL3-314(-292 bp～+22 bp)、pGL3-497(-475 bp～+22 bp)、pGL3-827(-805 bp～+22 bp)、pGL3-1222(-1 200 bp～+22 bp)。

图1 牛CART基因启动子5′端截短示意图Fig.1 Schematic diagram of bovine CART gene promoter 5′truncated promoter

将重组质粒瞬时转染至293T细胞48 h后,收集细胞并用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测每个样品中萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性,萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性的比值即为荧光素酶相对活性(relative luciferase activity, RLA)。

1.3.5 DNA pull down试验 针对CART核心启动子区域设计5′端生物素标记探针,交由伯信公司合成,NC探针选择编码β-半乳糖苷酶的LacZ基因。提取牛下丘脑组织核蛋白,Bradford法测定样品浓度,-80 ℃保存。上述生物素标记的目的探针和NC探针分别与链霉亲和素磁珠25 ℃结合1 h,向磁珠-探针混合物中加入核蛋白样品,4 ℃旋转孵育结合1 h。洗脱收集蛋白复合物,SDS-PAGE电泳分离蛋白条带并进行考马斯亮蓝染色。从考染后的胶块上切下差异条带,进行质谱检测。

1.3.6 质谱鉴定与数据处理 使用Orbitrap ExplorisTM480质谱仪进行质谱分析,液相所用A液为0.1%甲酸水溶液,B液为0.1%甲酸乙腈水溶液。取1 μg酶解后的蛋白胶条由自动进样器上样到Zorbax 300SB-C18 peptide traps,再经由色谱柱RP-C18进行分离,色谱柱以95%的A液进行平衡,流速为300 nL·min-1。分离梯度为:0～50 min,B液线性梯度4%～50%;50～54 min,B液线性梯度50%～100%;54～60 min,B液维持在100%。Q Exactive质谱仪对分离产物进行质谱分析。

Proteome Discover2.4对原始文件进行数据库检索,数据库为Bos taurus-ensembl-fasta,酶解方式为胰蛋白酶,固定修饰为Carbamidomethy,可变修饰为M Oxidation、Acetyl。TBtools绘制韦恩图并获取差异蛋白列表,Gene Ontology数据库(http://geneontology.org/)对差异蛋白进行GO富集分析,KEGG数据库(http://www.genome.jp/kegg/)分析差异蛋白参与的信号通路,AnimalTFDB 3.0在线分析数据库(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB/)进行转录因子与核心启动子互作分析。

1.3.7 过表达转录因子对CART启动子转录活性的影响 NCBI GenBank数据库中获取牛RFX5(GenBank登录号:XM_010803041)、CREB基因(GenBank登录号:NM_174285)、RFX1(GenBank登录号:XM_024994860)、JUND(GenBank登录号:NM_001103253)、TEAD4(GenBank登录号:XM_010805630)、TFAP2D(GenBank登录号:NM_001192329)、RELA(GenBank登录号:NM_001080242)序列,与pcDNA3.1(+)质粒连接构建过表达载体,交由上海吉玛制药技术有限公司合成;根据上述序列设计转录因子与β-actin定量引物,交由公司合成,引物信息见表1。

转录因子过表达载体分别与牛CART核心启动子双荧光素酶报告基因载体共转染293T细胞。转染24 h后,Trizol提取细胞总RNA,经反转录合成cDNA后进行RT-qPCR检测转录因子过表达情况,反应体系为:cDNA模板1 μL,TB Green Premix ExTaqⅡ 5 μL,上、下游引物各0.4 μL,ddH2O 3.2 μL。反应程序为:95 ℃预变性10 s;定量PCR反应95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,40个循环;熔解曲线:95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。以β-actin为内参基因,2-△△CT值计算基因相对表达量。转染48 h后,双荧光素酶报告基因系统检测细胞RLA。

1.3.8 统计分析 每个试验设置3个重复,通过GraphPad Prism 9.0软件统计分析试验数据,结果采用“平均值±标准误”表示,采用单因素方差分析比较CART截短启动子活性,采用t检验分析转录因子与CART核心启动子结合性各组间的差异,P>0.05表示无显著差异,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 牛CART基因启动子区序列扩增

以下丘脑基因组DNA为模板,PCR扩增牛CART基因候选启动子区域,扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测得到单一清晰、与目的产物一致的特异性扩增条带(图2),测序证实扩增产物与NCBI GenBank中牛CART基因序列一致,表明已成功获得牛CART基因1 222 bp的启动子序列。

M. DNA 相对分子质量标准DL2000;1～3.牛CART基因启动子扩增产物M. DL2000 marker; 1-3. PCR products of promoter for bovine CART gene图2 牛CART基因启动子PCR扩增产物Fig.2 PCR amplified product of promoter of bovine CART gene

2.2 牛CART基因启动子区序列特征分析

序列分析结果显示,牛CART基因启动子区内A碱基为256个(20.95%),T碱基为325个(26.60%),G碱基为298个(24.39%),C碱基为343个(28.07%)。牛CART基因TSS可能位于翻译起始位点ATG上游22 bp处的A碱基(记为+1),利用EMBOSS和MethPrimer数据库在线分析CpG岛位点,筛选标准为:GC%>50%、Island size>100以及Obs/Exp>0.60,结果显示牛CART基因启动子区含有1个CpG岛,位于-239 bp～-35 bp(205 bp)(图3A)。顺式作用元件位点预测结果显示,存在2个TATA box,分别位于-28～-21 bp和-846～-840 bp;8个CAAT box,分别位于-147～-142 bp、-809～-806 bp、-868～-865 bp、-896～-892 bp、-1 046～-1 043 bp、-1 087～-1 082 bp、-1 121～-1 118 bp和-1 166～-1 162 bp(图3B)。

A. CpG岛位点分析;B. 顺式作用元件位点预测A. Analysis of CpG island sites; B. Prediction of cis-acting element sites图3 牛CART基因启动子序列特征分析Fig.3 The sequence characteristic analysis of bovine CART gene promoter

2.3 牛CART基因核心启动子区鉴定

双荧光素酶活性检测结果显示,截短重组载体相对荧光活性均显著高于pGL-Basic对照载体,其中pGL-314的相对荧光活性显著高于pGL-497(图4),表明-292 bp～+22 bp内可能存在正向转录调控元件,该区域为牛CART基因转录所需的最短核苷酸序列,即牛CART基因的近端核心启动子区。

*. P<0.05; **. P<0.01; ns. P>0.05。下同*. P<0.05; **. P<0.01; ns. P>0.05. The same as below图4 牛CART基因启动子截短片段相对荧光活性检测Fig.4 Detection of the relative fluorescence activity of bovine CART gene promoter truncated fragments

2.4 DNA pull down筛选核心启动子区转录因子

DNA pull down产物进行SDS-PAGE分离及考马斯亮蓝染色,结果显示对照组(NC)与试验组(DPD)在40～55 ku间存在2条差异条带(图5)。质谱分析去除各组中特异性肽段数≤2的蛋白质后,DPD组获得互作蛋白921个,去除与NC组有交集的143个蛋白质后,共获得778个与NC组差异表达的蛋白质(图6)。

图5 差异性互作蛋白筛选Fig.5 Screening of differentially interacting proteins

图6 差异蛋白韦恩图Fig.6 Venn diagram of differential proteins

2.5 互作蛋白功能分析

GO功能富集分析显示,778个蛋白质中有15个具有DNA结合功能(图7A);KEGG分析显示,差异蛋白涉及的10条主要的信号通路包括:信号转导、内分泌调节、癌症发生、神经调节、细胞生长与凋亡、免疫调节、糖代谢、翻译、转录和能量代谢(图7B),其中RFX5、CREB、RFX1、JUND、TEAD4、TFAP2D、RELA共7个蛋白质具有基因转录调控功能,且均与牛CART核心启动子区存在结合位点(表2)。

A.分子功能富集分析;B.信号通路分析A. Molecular function enrichment analysis; B. Signaling pathway analysis图7 差异蛋白功能分析Fig.7 Functional analysis of differential proteins

表2 转录因子结合位点预测Table 2 Prediction of transcription factor binding sites

2.6 转录因子对CART基因核心启动子转录活性的影响

pcDNA3.1(+)-转录因子重组质粒瞬时转染至293T细胞,RT-qPCR检测细胞中转录因子表达水平。结果显示,转染pcDNA3.1(+)-RFX5、pcDNA3.1(+)-CREB、pcDNA3.1(+)-RFX1、pcDNA3.1(+)-JUND、pcDNA3.1(+)-TEAD4、pcDNA3.1(+)-TFAP2D、pcDNA3.1(+)-RELA后,细胞中相应的候选转录因子mRNA水平均极显著提高(P<0.01)(图8),表明转录因子过表达载体构建成功。应用双荧光素酶报告基因系统检测各转录因子对牛CART基因核心启动子区转录活性的影响,结果显示,过表达RFX5、RFX1、TEAD4后,293T细胞相对荧光活性显著下降(P<0.05);过表达CREB、RELA后293T细胞相对荧光活性极显著上升(P<0.000 1);过表达JUND、TFAP2D对293T细胞相对荧光活性无显著变化(P>0.05)(图9)。

A. RFX5过表达检测;B. CREB过表达检测;C. RFX1过表达检测;D. JUND过表达检测;E. TEAD4过表达检测;F. TFAP2D过表达检测;G. RELA过表达检测。***. P<0.001; ****. P<0.000 1,下同A. Overexpression detection of RFX5; B. Overexpression detection of CREB; C. Overexpression detection of RFX1; D. Overexpression detection of JUND; E. Overexpression detection of TEAD4; F. Overexpression detection of TFAP2D; G. Overexpression detection of RELA. ***. P<0.001; ****. P<0.000 1, the same as below图8 293T细胞内转录因子过表达检测Fig.8 Detection of transcription factors overexpression in 293T cells

A. RFX5组相对荧光活性检测;B. CREB组相对荧光活性检测;C. RFX1组相对荧光活性检测;E. JUND相对荧光活性检测;F. TEAD4组相对荧光活性检测;G. TFAP2D组相对荧光活性检测;H. RELA组相对荧光活性检测A. Relative fluorescence activity of RFX5 group; B. Relative fluorescence activity of CREB group; C. Relative fluorescence activity of RFX1 group; E. Relative fluorescence activity of JUND group; F. Relative fluorescence activity of TEAD4 group; G. Relative fluorescence activity of TFAP2D group; H. Relative fluorescence activity of RELA group图9 转录因子对牛CART基因核心启动子转录活性的影响Fig.9 Effects of transcription factors on transcriptional activity of bovine CART gene core promoter

3 讨 论

包裹在卵泡外周的GCs为卵母细胞发育提供营养物质,并通过分泌E2促进卵泡成熟和排卵[13],GCs凋亡是引起卵泡闭锁的主要原因[14]。研究发现,神经肽CART通过下丘脑-垂体-卵巢轴作用于GCs,抑制E2分泌[15],E2水平降低是卵泡闭锁的主要特征之一[16],低浓度的E2促进GCs凋亡[17]。前期对牛优势卵泡(dominant follicles, DFs)和从属卵泡(subordinate follicles, SFs)转录组测序分析发现,CART在DFs中表达量显著高于SFs,且主要在GCs层表达,认为CART通过促进CGs凋亡来影响E2分泌,进而对卵泡发育发挥抑制作用[18]。本课题组对CART在牛下丘脑表达的转录后水平调控机制进行了研究,发现bta-miR-377可与CART3′UTR区结合抑制CARTmRNA转录[19]。为进一步完善CART表达调控网络,本研究对牛CART基因表达转录水平调控机制进行了深入探究。

启动子是基因转录起始的关键区域,转录因子与该区域内的顺式作用元件结合,发挥转录增强或抑制作用。Yamada等[20]克隆获得人CART基因启动子序列,对TSS上游1 072 bp的序列进行结构分析,发现-156 bp处的基因多态性位点与肥胖遗传相关。Dominguez等[21]构建小鼠DNA文库,对CART基因测序鉴定后发现在近端启动子区内存在cAMP反应元件等多种顺式作用元件,且人和小鼠CART基因-320 bp～+1 bp区同源性高达83%。Ling等[22]分析猪CART5′端缺失启动子片段转录起始活性,确定-217 bp～+152 bp为猪CART转录起始所需的最短序列,即猪CART基因核心启动子区。本研究从牛下丘脑组织中扩增获得牛CART基因启动子片段,构建4个不同截短长度的启动子报告基因载体,筛选并鉴定CART基因核心启动子区,明确-292 bp～+22 bp区为牛CART基因核心启动子区。CpG岛通过甲基化影响转录因子与启动子的结合能力,在真核生物基因转录过程中发挥重要调控作用[23-24]。生物信息学分析结果显示,牛CART基因CpG岛位于核心启动子区,认为CART基因转录调控可能受到CpG岛甲基化的影响。

CREB是目前研究较为广泛的一类转录激活因子,主要参与调控神经元反应相关基因的表达[25],可通过磷酸化和去磷酸化调节靶基因转录[26],前人研究表明CREB激活大鼠下丘脑CART表达[10],本研究同样明确CREB对牛下丘脑CART转录发挥激活作用。RFX家族可与主要组织相容性抗原MHC Ⅱ类基因特异性结合影响机体免疫性应答,在真核生物的各类细胞中广泛表达并发挥基因转录激活作用[27-28]。RFX转录因子家族广泛存在于真核生物的各个组织中,通过与细胞增殖和迁移相关基因启动子结合发挥转录激活作用,进而影响癌症发生发展[29-30]。RFX1是已知的具有双向活性的转录因子[31];王娜等[32]研究表明,干扰神经元中RFX5表达导致Pcdhα基因水平显著上调,表明RFX5具有抑制基因转录的功能,本研究则发现RFX5可显著降低CART核心启动子转录活性,因此认为RFX5具有与RFX1相似的双向转录活性。TEAD4可与转录辅助激活因子YAP/TAZ结合发挥共激活作用,参与调节Hippo信号通路并影响癌症发生[33-34],另有研究发现,TEAD4参与介导PI3K/AKT 信号通路,促进膀胱癌细胞的迁移[35],还可在肝癌细胞中抑制p27基因的表达[36]。本研究筛选获得的转录因子JUND、TFAP2D和RELA均已被证明具有双向转录活性[37-40]。综上所述,转录因子在不同细胞中对不同基因转录调控方向有所不同,仅根据前人研究成果判断某转录因子对目的基因的转录调控作用易导致结果偏差。本研究应用双荧光素酶报告基因系统对RFX5、CREB、RFX1、JUND、TEAD4、TFAP2D、RELA 7个转录因子与牛CART基因核心启动子区的靶向结合关系进行验证,初步明确RFX5、RFX1、TEAD4抑制牛CART核心启动子转录活性;CREB与RELA增强牛CART核心启动子转录活性。本研究未针对牛下丘脑细胞及动物活体进行转录因子功能验证,后续将开展定点突变及细胞功能试验,并设计相应的转录因子靶向药物进行动物活体试验,探究转录因子对牛下丘脑CART分泌及卵泡发育的影响,进一步明确各转录因子与CART核心启动子区的靶向结合位点及相互作用关系。

4 结 论

本研究扩增获得牛CART基因启动子序列,预测该片段上存在CpG岛等多种涉及基因转录调控的顺式作用元件,确定-292 bp～+22 bp为CART核心启动子区,构建转录因子过表达载体并明确RFX5、RFX1、TEAD4为牛CART基因转录抑制因子,CREB与RELA为转录激活因子。上述结论为进一步揭示牛下丘脑CART转录调控机制奠定理论基础。