不同造模方法复制SD大鼠肩周炎模型的比较研究

桑莉莉，吴俊哲，高大伟

（中山市中医院骨科，广东中山 528400）

肩周炎是肩周肌肉、肌腱、滑囊、关节囊等软组织的慢性炎症，导致盂肱关节囊的炎性粘连、僵硬及慢性退变，以关节疼痛、活动受限（以外展、外旋和后伸为主）为临床特征的疾病，多发于50 岁左右的中老年人，女性发病率高于男性，左肩多于右肩[1-2]。由于肩周炎的临床表现复杂，病程持续1～2年，甚至治愈后仍遗留肩关节功能受限，研究[3]表明，肩周炎主要病理表现为喙肱韧带、肱二头肌下滑囊等无菌性炎症粘连、肌腱组织纤维化增生和变性等；但其具体病理机制尚不明确。因此，越来越多的学者采用动物模型进行肩周炎的病理机制研究。根据既往文献常用的肩周炎动物模型分为以下4 种：风寒湿刺激模型[4]、持续机械劳损加冰敷模型[5]、手术损伤模型[6]和石膏制动模型[7-8]；但其模型稳定性如何尚不清楚。因此，本研究建立以上4 种肩周炎SD 大鼠模型，比较其炎症以及纤维化的情况，筛选稳定有效的造模方法，以期为肩周炎的发病机制及药效学研究提供基础支撑，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物100只无特殊病原体（SPF）级雄性SD 大鼠，（7 ± 0.5）周龄，体质量（0.20～ 0.22）kg，由广东省医学实验动物中心[实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2018-0001]提供。动物饲养环境控制在温度18～ 26 ℃，相对湿度40%～ 70%，噪音85分贝以下，通风换气8～12次/h。本动物实验方案已通过中山市中医院动物实验伦理委员会批准（伦理批号：2023ZSZY-LLK-291）。

1.2 主要试剂与仪器苏木素-伊红（HE）染液（武汉谷歌生物科技公司）；兔抗环氧合酶1（COX-1）抗体、兔抗降钙素基因相关肽（CGRP）受体成分蛋白（CRCP）抗体、兔抗泛素羧基末端水解酶（UCHL）抗体（美国Proteintech 公司）；肿瘤坏死因子α（TNF-α）（美国Abcam 公司）；兔抗转化生长因子β（TGF-β）抗体（美国Bioss 公司）；山羊抗兔IgG二抗（美国Servicebio 公司）。RM2016 组织切片机（上海徕卡仪器有限公司）；NIKON ECLIPSE CI 正置光学显微镜、NIKON DS-U3成像系统（日本尼康公司）；WD-9405A脱色摇床（北京市六一仪器厂）。

1.3 动物分组与干预将100 只SD 大鼠随机分为5组，即风寒湿刺激模型组、持续机械劳损加冰敷模型组、手术损伤模型组、石膏制动模型组、空白对照组，每组20只。

风寒湿刺激模型[4]：模拟风寒湿条件刺激肩关节。大鼠肩部局部去毛后，给予中强度风、寒、湿连续刺激（风力5级、9～10 ℃、90%湿度，连续刺激6 h，连续6 d）。

持续机械劳损加冰敷模型[5]：用薄剪剃除大鼠右肩部外侧约6 cm × 6 cm 面积大小的毛发，固定大鼠左前肢和两后肢，然后连接右前肢与水平摇床。水平摇床采用240 次/min 频率、1.5 cm 振幅，6 h/d，共3 d。每次机械劳损后，将自制的装满冰块的肩袖袋外敷于大鼠右肩部，6 h/d，共3 d，注意当冰块融化将尽时予更换冰袋。

手术损伤模型[6]：大鼠麻醉满意后，采用弯钳于冈上肌、斜方肌肩峰附着部和三角肌、三角肌下滑囊等处做牵拉及持续的钝性摩擦，造成局部瘀肿淤血。

石膏制动模型[7-8]：大鼠麻醉满意后，将石膏绷带固定右肩部后伸30°位置（肩关节内旋位）。每天观察石膏是否破坏或松动。注意观察大鼠是否可依靠左前肢爬行、站立以及自主饮食。如有大鼠石膏被破坏或松动，此情况达不到制动效果，需要及时重新制作并更换石膏。

空白对照组不做处理。清洁级条件正常饮食喂养。

1.4 取材造模完成后第1、2、4、8周取材。大鼠麻醉满意后，将大鼠俯卧固定，暴露右肩关节，用薄剪在肩关节软骨组织取材，放置4%多聚甲醛溶液中固定，留待进行HE 染色、免疫组织化学染色。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 HE 染色法观察肩关节软骨组织病理学形态 将肩关节软骨组织石蜡切片脱蜡至水。切片入Harris 苏木素染色3～ 8 min，自来水洗，1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6%氨水返蓝，流水冲洗。切片入伊红染液中染色1～3 min。脱水透明，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集分析。细胞核呈蓝色，细胞质呈红色。

1.5.2 免疫组织化学染色法检测肩关节软骨组织炎症因子（COX-1、TNF-α），纤维化因子（TGF-β），神经内分泌因子（CRCP、UCHL）表达 将肩关节软骨组织石蜡切片脱蜡至水，EDTA 抗原修复缓冲液（pH9.0）抗原修复，3%过氧化氢溶液室温避光孵育25 min，3%BSA 室温封闭30 min。分别加一抗COX-1（1∶200）、TNF-α（1∶100）、TGF-β（1∶100）、CRCP（1∶200）、UCHL（1∶500）稀释液4 ℃孵育过夜，加二抗（1∶500）室温孵育50 min，DAB 显色，Harris 苏木素复染3 min 左右，1%的盐酸酒精分化数秒，氨水返蓝，脱水透明，中性树胶封片。每步骤中间要PBS 洗涤3次，每次5 min。显微镜镜检，图像采集分析。采用Image-Pro Plus 6.0软件分析累积光密度值（IOD）以及组织的像素面积（AREA）。并求出平均光密度（AO）值，AO=IOD/AREA，AO 值越大表示目的蛋白阳性表达水平越高。

1.6 统计方法采用SPSS 21.0 软件包处理数据。计量资料以均数±标准差（）表示，符合正态分布，采用方差齐性检验，方差齐则采用独立样本t检验，自身对照均值比较，采用配对t检验；非正态分布的计量资料采用中位数比较则采用Mann-WhitneyU非参数检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组模型大鼠肩关节软骨组织病理学形态比较图1结果显示：与空白对照组比较，风寒湿刺激模型组、持续机械劳损加冰敷模型组肩关节软骨细胞逐渐减少，关节表面软骨逐渐纤维化，手术损伤模型组肩关节软骨细胞于造模完成后第2 周时增多，然后逐渐减少，关节表面软骨逐渐纤维化，石膏制动模型组肩关节软骨细胞逐渐减少，于造模完成后第8 周时关节表面软骨纤维化，软骨层增生，未见明显软骨下层骨组织细胞。

图1 各组模型大鼠造模完成后不同时间肩关节软骨组织病理学形态比较（HE染色，×100）Figure 1 Comparison of cartilage histopathological morphology of the shoulder joint at different times after completion of modelling among various model groups of rats（HE staining，×100）

2.2 各组模型大鼠肩关节组织炎症因子（COX-1、TNF-α），纤维化因子（TGF-β），神经内分泌因子（CRCP、UCHL）表达比较

2.2.1 炎症因子 图2 结果显示：空白对照组大鼠造模完成后第1～8 周肩关节组织COX-1 表达逐渐减少；风寒湿刺激模型组、持续机械劳损加冰敷模型组、手术损伤模型组造模完成后第1～4 周COX-1 表达逐渐增加，第4 周达到最高值，至第8 周逐渐减少；石膏制动模型组于造模完成后第1～ 2 周COX-1 表达逐渐增加达到最高，至第4 周降低，第8周逐渐增加。组间比较，风寒湿刺激模型组、持续机械劳损加冰敷模型组、手术损伤模刺激组、石膏制动模型组COX-1 表达最高值均高于空白对照组最高值（P＜0.05）。

图2 各组模型大鼠造模完成后不同时间肩关节组织COX-1表达比较Figure 2 Comparison of COX-1 expression in shoulder joint tissue at different times after completion of modelling among various model groups of rats

图3结果显示：空白对照组大鼠造模完成后第1～8 周肩关节组织TNF-α 表达逐渐增加；风寒湿刺激模型组、石膏制动模型组大鼠造模完成后第1～ 4 周TNF-α 表达逐渐减少，至第8 周表达增加；持续机械劳损加冰敷模型组大鼠造模完成后第2～8周TNF-α 表达逐渐减少。组间比较：风寒湿刺激模型组、手术损伤模型组第1～2 周TNF-α 表达高于空白对照组，持续机械劳损加冰敷模型组在第1～ 4 周均高于空白对照组，石膏制动模型组在第1～8 周均高于空白对照组（P＜0.05）。

图3 各组模型大鼠造模完成后不同时间肩关节组织TNF-α表达比较Figure 3 Comparison of TNF-α expression in shoulder joint tissue at different times after completion of modelling among various model groups of rats

2.2.2 纤维化因子 图4 结果显示：空白对照组大鼠造模完成后第1～8 周肩关节组织TGF-β 表达逐渐减少；风寒湿刺激模型组、持续机械劳损加冰敷模型组、手术损伤模型组、石膏制动模型组TGF-β表达均先增加再降低，均在第2周达到最高值。组间比较，持续机械劳损加冰敷模型组、石膏制动模型组TGF-β 在第2 周时最高值大于其他各组最高值（P＜0.05）。

图4 各组模型大鼠造模完成后不同时间肩关节组织TGF-β表达比较Figure 4 Comparison of TGF-β expression in shoulder joint tissue at different times after completion of modeling among various model groups of rats

2.2.3 神经内分泌因子 图5 结果显示：空白对照组大鼠造模完成后第1～ 8 周肩关节组织CRCP表达逐渐增加；风寒湿刺激模型组、持续机械劳损加冰敷模型组、手术损伤模型组大鼠造模完成后第1～2周CRCP 表达逐渐增加，第2周达到最高值，至第8周逐渐减少；石膏制动模型组大鼠造模完成后第1～ 8 周CRCP 表达逐渐减少。组间比较，风寒湿刺激模型组、持续机械劳损加冰敷模型组、手术损伤模型组CRCP 表达在第2 周最高值高于空白对照组（P＜0.05），石膏制动模型组在第1 周最高值高于空白对照组（P＜0.05）。

图6结果显示：空白对照组、风寒湿刺激模型组大鼠造模完成后第1～ 2 周肩关节组织UCHL 表达先增加，至第4 周再降低，至第8 周再增加；持续机械劳损加冰敷模型组、手术损伤模型组、石膏制动模型组UCHL表达均先增加再减少，持续机械劳损加冰敷模型组、手术损伤模型组在造模完成后第2 周达到最高值，石膏制动模型组在第4 周达到最高值。组间比较，风寒湿刺激模型组、持续机械劳损加冰敷模型组、手术损伤模型组、石膏制动模型组大鼠在造模完成后第1、2、4、8 周UCHL表达均高于空白对照组（P＜0.05）。

图6 各组模型大鼠造模完成后不同时间肩关节组织UCHL表达比较Figure 6 Comparison of UCHL expression in shoulder joint tissue at different times after completion of modeling among various model groups of rats

3 讨论

肩周炎主要发病阶段分为急性期、慢性期和恢复期，早期以关节囊炎症为主，慢性期以纤维化为主，恢复期纤维化自发消退。本研究中肩关节组织HE 染色结果显示：风寒湿刺激模型组、持续机械劳损加冰敷模型组肩关节软骨细胞逐渐减少，关节表面软骨逐渐纤维化；手术损伤模型组肩关节软骨细胞于造模完成后第2周时增多，然后逐渐减少，关节表面软骨逐渐纤维化；石膏制动模型组肩关节软骨细胞逐渐减少，造模完成后第8 周时关节表面软骨纤维化，未见明显软骨细胞。表明这4种方法构建的肩周炎动物模型均可见关节软骨细胞减少、表面纤维化。

肩周炎是炎症和纤维化的过程，早期滑膜增生、血管数量增多，与无菌性炎症、纤维化过程密切相关。COX-1 主要参与炎症和胶原分解代谢过程。TNF-α 为促炎性反应细胞因子[9]。有研究[10-11]表明，肩峰下滑囊、关节囊中COX-1、TNF-α等炎症细胞因子的表达增加与肩关节的肿痛症状以及炎症转化为纤维化的发病机制有关。炎性细胞因子表达增加可诱导炎症级联反应，最终导致肩周炎的非自然组织修复和纤维化。本研究结果显示：风寒湿刺激模型组、持续机械劳损加冰敷模型组、手术损伤模型组、石膏制动模型组COX-1 表达在造模完成后第1～ 8 周最高值均高于空白对照组最高值。风寒湿刺激模型组、手术损伤模型组TNF-α 表达在造模完成后第1～2 周高于空白对照组，持续机械劳损加冰敷模型组TNF-α表达在造模完成后第1～ 4 周均高于空白对照组，石膏制动模型组TNF-α表达在造模完成后第1～8周均高于空白对照组。故石膏制动模型在炎症因子表达稳定性方面优于风寒湿刺激模型、持续机械劳损加冰敷模型、手术损伤模型。

TGF-β 作为生长与分化因子可调节生长、发育、炎症、修复和免疫等生物学过程，可促进成纤维细胞合成胶原蛋白、纤维黏连蛋白及蛋白多糖等细胞外基质，还可促进上皮细胞转变为成纤维细胞，可直接促进成纤维细胞合成胶原，并使组织间上皮细胞相互识别或通过促使巨噬细胞分泌成纤维细胞生长因子，进一步促进成纤维细胞合成和分泌胶原纤维，而当胶原纤维过度沉积时就会导致瘢痕组织和粘连的形成[12-13]。Redeo 等[14]研究表明，TGF-β 对肩周炎患者滑膜增生和关节纤维化有重要作用。本研究结果显示：风寒湿刺激模型组、持续机械劳损加冰敷模型组、手术损伤模型组、石膏制动模型组TGF-β 表达均先增加再降低，均在造模完成后第2周达到最高值，持续机械劳损加冰敷模型组、石膏制动模型组TGF-β表达在造模完成后第2周时最高值大于其他各组最高值。故持续机械劳损加冰敷模型、石膏制动模型在肩关节纤维化相关因子稳定表达方面优于风寒湿刺激模型、手术损伤模型。

有研究[15]表明，神经和血管因素与肩周炎的发病过程亦相关，CGRP 分布在血管周围或成纤维细胞中，其表达增加可造成血管增多、滑膜囊增厚和挛缩。CGRP 作为促炎症性神经肽，在疼痛感觉传递中起重要作用[16]。UCHL 为泛素C 末端水解酶在神经元中高表达，参与调解蛋白的聚集并维持其稳定，UCHL 缺失可导致神经元细胞凋亡[17]。本研究结果显示：风寒湿刺激模型组、持续机械劳损加冰敷模型组、手术损伤模型组CRCP 表达在造模完成后第2周最高值高于空白对照组，石膏制动模型组在造模完成后第1 周最高值高于空白对照组。风寒湿刺激模型组、持续机械劳损加冰敷模型组、手术损伤模型组、石膏制动模型组在造模完成后1～ 8 周UCHL 表达均高于空白对照组。表明手术损伤模型和石膏制动模型在肩关节致痛因子表达方面优于风寒湿刺激模型、持续机械劳损加冰敷模型。

综上所述，针对肩周炎的4种SD大鼠模型——风寒湿刺激模型、持续机械劳损加冰敷模型、手术损伤模型、石膏制动模型，研究者可根据不同的实验研究目的进行选择。