改进HPLC-ICP-MS法测定食品中的无机砷

刘立秋

（中国检验认证集团上海有限公司，上海 201201）

砷存在多种形态，其毒性与存在形态密切相关，不同形态的砷对人体作用差别很大[1]。食品中砷的常见形态为砷甜菜碱（Arsenic Betaine，AsB）、二甲基砷（Dimethyl Arsenic，DMA）、一甲基砷（Monomethyl Arsenic，MMA）、五价无机砷（AsⅤ）、三价无机砷（AsⅢ）。无机砷的毒性大于有机砷，而无机砷中AsⅢ的毒性又远远大于AsⅤ[2-3]，甲基化的砷毒性较小，而AsB被认为是无毒的，其毒性从大到小依次为AsⅢ＞AsⅤ＞MMA＞DMA＞AsB[4]。不同种类的食品中砷形态组成差别较大，总砷含量较大的食品可能无机砷的含量很小，因此进行砷的形态分析比单纯用砷的总量评价食品安全性更具科学性。目前，高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，HPLC-ICP-MS）是《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》（GB 5009.11—2014）[5]规定的测定食品中无机砷的方法，但在实际工作中参照国标规定的方法条件测定食品中的无机砷具有一定局限性，无法完全分离DMA和AsⅢ的色谱峰，会出现无机砷检测值偏高或假阳性结果。本研究通过改变流动相组成及洗脱程序优化了HPLC-ICP-MS方法，能使DMA和AsⅢ色谱峰完全分离开，不同种形态砷的色谱峰分离度得到了提高。为进一步验证该改进方法测定食品中无机砷的可靠性，采用无机砷空白米粉作为样品基质，对其无机砷的检出限进行测定，并进行精密度和回收率分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260液相色谱-Agilent 7700X电感耦合等离子体质谱联用仪（安捷伦科技有限公司）；CEM MARS 2微波消解仪（美国CEM公司）；飞鸽GL-20G-II高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）。

砷甜菜碱、二甲基砷、一甲基砷标准溶液（中国计量科学研究院）；AsⅤ、AsⅢ标准溶液（o2si公司）；氩、氦，均为99.999%；超纯水（电阻率达到18.25 MΩ·cm）；无水乙酸钠、磷酸二氢钠、硝酸钾、乙二胺四乙酸二钠、碳酸铵、氨水、乙酸和无水乙醇，均为优级纯；仪器调谐液：浓度各为1 μg·L-1的Li、Y、Ce、Tl、Co混合溶液。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

称取已制备好的米粉1.0 g（准确至0.001 g），置50 mL聚丙烯离心管中，加入20 mL 0.15 mol·L-1HNO3溶液，放置过夜。置90 ℃恒温箱中热浸提2.5 h，每0.5 h振摇1 min。提取完毕，取出冷却至室温，8 000 r·min-1离心15 min，取上层清液，经0.45 μm有机滤膜后进样测定，同时做空白试验。

1.2.2 仪器工作条件

（1）液相色谱工作条件。①GB 5009.11—2014标准提供的液相色谱工作条件。流动相C为10 mmol·L-1无水乙酸钠+3 mmol·L-1硝酸钾+10 mmol·L-1磷酸二氢钠+0.2 mmol·L-1乙二胺四乙酸二钠缓冲液+1%乙醇，用氨水调节pH＝10.0；色谱柱为HAMILTON PRP-X100 10 μm COL 250 mm×4.1 mm；流动相流速为1.0 mL·min-1，进样体积为20 μL，洗脱方式为等度洗脱。②本研究改进后的液相色谱工作条件。流动相A为0.1 moL·L-1碳酸铵+2%甲醇，用氨水或乙酸调pH值，使pH=8.8～9.0；流动相B为2%甲醇水溶液；色谱柱为HAMILTON PRP-X100 10 μm COL 250 mm×4.1 mm（与改进前的实验使用同一根色谱柱）；流动相流速为1.0 mL·min-1，进样体积为20 μL，洗脱方式为梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

（2）ICP-MS工作条件。射频功率为1 500 W，等离子体气流量为15 L·min-1，雾化器流量为1.00 L·min-1，氦气流量为（碰撞池）4.5 mL·min-1，雾化室温度为2 ℃。

2 结果与分析

2.1 实验条件改进结果

图1为使用GB 5009.11—2014标准的流动相和洗脱程序形成的色谱图，图2为使用改进后的流动相和洗脱程序形成的色谱图，两色谱图的进样溶液（AsB、DMA、MMA、AsⅤ和AsⅢ）浓度均为50 μg·L-1。从图1、图2可以看出，使用GB 5009.11—2014标准的流动相和洗脱程序形成的色谱图中，DMA和AsⅢ色谱峰重叠在一起，而使用改进后的流动相和洗脱程序形成的色谱图分离度很好，能把DMA和AsⅢ色谱峰完全分离开。

图1 GB 5009.11—2014标准方法的色谱图

图2 改进方法的色谱图

通常，色谱柱使用时间越长，柱效会越差，不同批次的同一类色谱柱，柱效也不一样，当色谱柱柱效不能满足实验的分离度时，可以通过改变洗脱程序中流动相的比例来调整和优化。流动相中碳酸铵的浓度越高，各组分的保留时间越短，因此可以通过调节流动相中碳酸铵的比例来调节各组分的保留时间和分离度。实验过程中分离度不好时，适当增加流动相B的比例，可以提高各色谱峰的分离度，以满足检测要求。

2.2 方法的线性考察

取适量的AsⅤ和AsⅢ标准溶液，用超纯水制备成浓度为2.5 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、50.0 μg·L-1和100.0 μg·L-1的系列标准溶液，使用改进后的HPLC-ICP-MS方法检测，得到标准曲线回归线方程。AsⅢ：y=8 029.912 821x，相关系数R=0.999 3；AsⅤ：y=12 993.529 5x+6 024，相关系数R=0.999 3。由此可知，在2.5～100.0 μg·L-1，该方法的线性相关性很好。

2.3 方法检出限的测定

称量空白米粉7份，每份1.0 g，在7份空白米粉中各加入10 μL 1 000 μg·L-1的AsⅢ和AsⅢ混合标准溶，按1.3.1进行处理，采用流动相改进的HPLCICP-MS方法测定。根据3倍信噪比确定检出限，检出限=3X/（S/N），其中X=10×1 000/1.0=0.01 mg·kg-1，米粉AsⅢ检出限为0.002 8 mg·kg-1，米粉AsⅤ检出限为0.003 2 mg·kg-1，而GB 5009.11—2014标准中米粉的检出限为0.01 mg·kg-1，可见流动相改进后的方法检出限更低。AsⅢ、AsⅤ检出限测定结果见表2。

表2 检出限测定结果

2.4 方法精密度与回收率的测定

称量空白米粉22份，每份1.0 g，1份空白米粉不加标，其余21份空白米粉分3组7平行分别加入1 000 μg·L-1的标准混合溶液50 μL、100 μL、500 μL，按1.3.1进行处理，采用改进的HPLC-ICPMS法测定精密度与回收率，结果见表3。方法回收率为92.4%～95.4%，精密度（RSD）为1.41%～2.70%，符合相关标准要求。

表3 精密度与回收率测定结果（n=7）

3 结论

砷的毒性与其形态密切相关，无机砷有剧毒，有机砷则几乎无毒，砷的形态分析对于食品安全的研究具有重大意义。按照GB 5009.11—2014规定的流动相及洗脱程序测定食品中的无机砷，会出现DMA和AsⅢ色谱峰重叠，致使无法准确测定食品中无机砷的含量，因此本研究对该方法的流动相和洗脱方式进行了改进。使用改进后的HPLC-ICP-MS法测定食品中的无机砷，各峰分离度高，能把DMA和AsⅢ完全分离开来，提高了无机砷检测的准确性。相对于国标方法，改进后的流动相组成简单且不含钠盐，对色谱柱损害小，灵敏度更高。本研究采用米粉作为样品基质，对该方法的线性、检出限、精密度和回收率进行了考察，结果显示，在无机砷浓度为2.5～100.0 μg·L-1时，该方法的线性相关性很好，检出限比改进前低很多，精密度和回收率良好。