槲皮素通过生长抑制特异性基因5调节微小RNA-23a-3p和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路抑制垂体神经内分泌肿瘤的增殖机制

李 杰,李 瑞,李虹良,陈康雪,孙中磊

(北京精诚博爱医院神经二科,北京 100015)

垂体神经内分泌肿瘤(Pituitary neuroendocrine tumors,PitNETs)是一种常见的神经和内分泌系统肿瘤,约占颅内肿瘤的8%～15%。虽然手术切除是PitNETs的主要临床治疗方法,然而许多PitNETs患者仍存在肿瘤复发的风险[1]。因此,研究 PitNETs 异常生长的分子机制对于发现新的治疗靶点和提高患者生存率具有重要意义。有研究表明,生长抑制特异性基因5 (Growth arrest-specific transcript 5,GAS5)在多种恶性肿瘤中表达下调,其过表达能够抑制多种肿瘤细胞系的生长[2-4]。而最近的研究表明,GAS5可以通过微小RNA-23a-3p (miR-23a-3p) /磷酸酶和紧张素同系物(PTEN)/ 磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶 B(AKT)通路抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭[5],这可能是GAS5通过吸附微小RNA-23a(miR-23a)发挥作用的[6]。PI3K/AKT信号通路作为抑癌信号通路被证明可以促进垂体肿瘤细胞自噬而发挥抑癌作用[7]。槲皮素(Quercetin)作为一种天然小分子黄酮类化合物,在抗癌作用研究中取得了许多进展,已知信号通路包括分泌型糖蛋白/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)、磷脂酰肌醇3激酶/磷酸激酶B (PI3K/AKT)、Janus激酶/信号转导子和转录激活子(JAK/STAT)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、细胞肿瘤抗原p53/核因子激活的B细胞的κ-轻链增强(p53/NFκB)通路,在预防肿瘤生长、增殖和进展中发挥重要的作用[8-9]。而最近的研究发现,槲皮素可以在乳腺癌细胞中促进GAS5的表达[10],槲皮素(Quercetin)能否在PitNETs中调节GAS5/miR-23a-3p水平仍未可知。因此,探究槲皮素在PitNETs调节GAS5/miR-23a-3p功能可能为PitNETs治疗提供了新的方向。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人垂体瘤细胞系RC-4B/C购自上海中科院细胞库;DMEM培养基和其他细胞培养物品购自Gibco(北京)公司;槲皮素(货号100081-201610)购自Sigma Aldrich公司;PI3K (ab97862)、磷酸化 PI3K(p-PI3K)(ab302958)、AKT (ab283852)、磷酸化 AKT(p-AKT)(ab8805)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)(ab4674)均购abcam公司;Magna RIP RNA 结合蛋白免疫沉淀试剂盒(货号17-700)购自Millipore(上海)公司;Lipofectamine 2000转染试剂(12566014)、RPMI 1640、Opti-MEM培养基购自Life Technologies上海公司;wt-GAS5、mut-GAS5、mimic NC、miR-23a-3p mimic、si-GAS5由上海赛默飞世尔科技公司合成,DIPI(19269-67-1) MTT、RIP 缓冲液、RT-qPCR引物、内参、Trizol及去RNA酶处理的物品购自上海赛默飞世尔科技公司,Tranwell小室、细胞培养板及计数板购自美国康宁公司。

1.2 实验方法

1.2.1 RC-4B/C细胞培养及转染:选取 RC-4B/C 细胞,在37 ℃和含5% CO2的条件下用含10%胎牛血清、1% 100 U/L青/链霉素的DMEM 培养基进行常规培养。取对数生长期细胞铺板在0.5 ml含血清,不含抗生素的正常培养基中。按照试剂说明书使用Lipofectamine 2000试剂分别转染wt-GAS5、mut-GAS5、mimic NC、miR-23a-3p mimic、si-GAS5入RC-4B/C细胞,48 h后检测报告基因活性。免疫荧光观察RC-4B/C 细胞形态及数目,绿色GFAP,蓝色DIPI。试验分组:对照组(Control)、槲皮素组(Quercetin)、GAS5抑制组(Si-GAS5)和槲皮素+si-GAS5组(Quercetin+si-GAS5)组。

1.2.2 RT-qPCR检测RC-4B/C细胞中miR-23a-3p与GAS5 miRNA表达水平:RC-4B/C细胞在转染 48 h后,采用 Trizol 法提取细胞总RNA。将总 RNA(1 μg)逆转录为 miRNA 反应所需的 cDNA,反应程序为 37 ℃ 60 min,85 ℃ 5 min。将细胞总 RNA(1 μg)反转录为 cDNA,反应程序为两步法:第 1 步 65 ℃ 5 min;第 2 步 42 ℃ 60 min,85 ℃ 5 min。miRNA反应以通用引物为上游引物及 All-in-OneTM miRNA qPCR primer 为实时定量miRNA 特异引物,使用 SYBR 法扩增 miR-23a-3p片段,以 U6 作为内参。GAS5 miRNA 反应以 GAPDH miRNA作为内参。反应条件为:95 ℃变性 10 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸 15 s,重复 40个循环。Ct 值根据2-ΔΔCt算法处理得到基因的相对表达量,结果以(平均值±标准差)表示。基因及引物序列见表 1。

表1 实时PCR中使用的引物序列

1.2.3 MTT检测RC-4B/C细胞活性:采用MTT法检测RC-4B/C细胞活性,取对数生长期的各组细胞计数(2×105个/ml)后接种于96孔板,每孔50 μl,每组设置3个复孔。培养12 h后,每孔加MTT溶液20 μl,继续孵育4 h,加150 μl DMSO,终止反应,490 nm波长下测定各实验孔OD值,连续记录48 h,绘制细胞生长曲线。

1.2.4 Transwell小室检测RC-4B/C细胞侵袭能力:取重悬各组细胞(1×104/ml)200 μl加入Transwell小室中,置于实验孔中培养24 h;取出Transwell小室,去除小室薄膜上层细胞,结晶紫染色薄膜下层细胞后,置于显微镜下计数拍照。

1.2.5 双荧光素酶报告实验验证miR-23a-3p与 GAS5特意结合:将含有与miR-23a-3p 结合位点的野生型 (WT) 或突变型lncRNA GAS5 分别克隆到pmirGLO 荧光素酶载体 (Promega,Madison,WI,USA) 中。使用 Lipofectamine 2000 将 24 孔板上的细胞与野生型或突变质粒和 miR-23a-3p mimic或 mimic NC共转染。使用双荧光素酶报告分析系统测量荧光素酶活性。

1.2.6 RNA免疫沉淀(RIP)验证miR-23a-3p与 GAS5特意结合:按照试剂说明使用 Magna RIP RNA 结合蛋白免疫沉淀试剂盒检测。采用生长到70%～80% 汇合度的 PitNET 细胞并在 RIP 缓冲液中裂解。将细胞裂解物与抗 Ago2(Sigma Aldrich,MO,USA)或与琼脂糖珠结合的抗 IgG 抗体共免疫沉淀。最后,纯化共沉淀的 RNA 并用于 qRT-PCR 分析。

1.2.7 Western blot检测RC-4B/C细胞PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达水平:转染后,收获细胞并在放射免疫沉淀测定裂解缓冲液中在 4 ℃下裂解 30 min。使用BCA 蛋白质测定试剂盒对蛋白质浓度进行定量。蛋白质样品在 10% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离,并转移到聚偏二氟乙烯膜。在室温下用 5%脱脂牛奶封闭 1 h后,在 4 ℃[PI3K1∶1000稀释;磷酸化PI3K(p-PI3 K) 1∶2000 稀释; AKT 1∶2000稀释;磷酸化 AKT(p-AKT)1∶2000稀释]。然后将膜洗涤并与二抗(1∶2000稀释)在室温下孵育1 h。然后,将化学发光试剂均匀加入膜中,用显影液显影。在实验期间对所有蛋白质印迹进行相对光密度分析。

2 结 果

2.1 GAS5与miR-23a-3p直接结合 经过生物信息学网站Starbase 数据库(https://starbase.sysu.edu.cn/)预测,miR-23a-3p作为保守序列与lncRNA GAS5竞争性结合,作用位点见图1A。双荧光素酶报告实验检测结果表明,miR-23a-3p mimic组显著降低了wt-GAS5 载体的荧光素酶活性[(0.46±0.08)与(1.04±0.05)](t=15.06,P=0.001),但未能改变 mut-GAS5 载体的荧光素酶活性[(1.12±0.14)与(1.11±0.15)](t=0.119,P=0.907,见图 1B)。RIP检测显示 lncRNA GAS5 和 miR-23a-3p 在Ago2颗粒有明显统计学差异[(189.3±25.8)与(268.4±31.6)](t=4.750,P=0.001),在anti-IgG颗粒无统计学差异(P>0.05),见图1B。

注:A图为使用 RegRNA 网站分析 GAS5 和 miR-23a-3p 之间的相互作用位点;B图为通过荧光素酶报告基因测定检查lncRNA GAS5和miR-23a-3p之间的相互作用活性;C图为RIP检测证实了lncRNA GAS5和miR-23a-3p在RC-4B/C细胞中的相互作用。与miR-23a-3p mimic比较,*P <0.05

2.2 槲皮素促进 GAS5的表达水平比较 与对照组相比,Quercetin组GAS5表达水平明显增加[(1.59±0.08)与(1.01±0.05)],抑制GAS5组GAS5表达水平明显减少[(0.15±0.03)与(1.01±0.05)],槲皮素可以逆转GAS5抑制,增加GAS5的表达水平[(0.76±0.04)与(0.15±0.03)],相比较差异具有统计学意义(均P<0.05)。见图2。

注: 与Control组比较,*P<0.05,**P<0.01;与si-GAS5组比较,#P<0.05

2.3 槲皮素抑制miR-23a-3p和PI3K/AKT的表达水平比较 与对照组相比,Quercetin组miR-23a-3p表达水平明显下降[(0.35±0.04)与(1.01±0.05)],PI3K[(0.75±0.10)与(1.21±0.09)]和AKT[(0.55±0.05)与(0.65±0.08)]的磷酸化水平明显下降,si-GAS5组miR-23a-3p表达水平明显下降[(1.65±0.08)与(1.01±0.05)],PI3K[(1.45±0.12)与(1.21±0.09)]和 AKT [(0.86±0.06)与(0.65±0.08)]的磷酸化水平明显升高,差异具有统计学意义(均P<0.05);而Quercetin+si-GAS5组miR-23a-3p表达水平较si-GAS5组明显下降[(1.24±0.05)与(1.65±0.08)],PI3K[(0.89±0.11)与(1.45±0.12)]和AKT[(0.71±0.05)与(0.86±0.06)]的磷酸化水平明显下降,差异具有统计学意义(均P<0.05)。见图3。

注:A图为miR-23a-3p的表达情况;B图为PI3K/AKT及其蛋白磷酸化免疫印迹条带;C图为p-PI3K较PI3K表达情况; D图为p-AKT较AKT表达情况。与Control组比较,*P <0.05,**P <0.01;与si-GAS5组比较,#P <0.05

2.4 槲皮素抑制RC-4B/C细胞增殖和侵袭 实验72 h MTT实验结果显示,与对照组细胞相比,Quercetin组细胞增值率[(0.192±0.025)与(0.261±0.017)]和细胞数[(46.3±4.6)与(72.5±6.3)]明显降低,si-GAS5组细胞增值率[(0.295±0.031)与(0.261±0.017)]和细胞数[(156.3±12.4)与(72.5±6.3)]明显增加,差异具有统计学意义(均P<0.05);而Quercetin+si-GAS5组细胞增值率和细胞数较si-GAS5组明显降低[(0.275±0.018)与(0.295±0.031)]、[(91.5±11.6)与(156.3±12.4)],差异具有统计学意义(均P<0.05),见图4A。PI3K/AKT及其蛋白磷酸化免疫印迹条带见图4B。结果显示,与对照组细胞相比,Quercetin组穿膜细胞数[(59.3±5.8)与(96.1±7.2)]明显降低,si-GAS5组穿膜细胞数[(265.3±14.6)与(96.1±7.2)]明显增加,差异具有统计学意义(均P<0.05);而Quercetin+si-GAS5组穿膜细胞数较si-GAS5组明显降低[(78.3±9.6)与(265.3±14.6)],差异具有统计学意义(P<0.05),见图4C。

注:A图为RC-4B/C细胞MTT试验;B图为RC-4B/C细胞免疫荧光染色(×200);C图为RC-4B/C细胞Transwell试验。与Control组比较,*P<0.05;与si-GAS5组比较,#P<0.05

3 讨 论

大量研究报道lncRNAs在肿瘤的发生和发展过程中发挥着极其重要的作用。 lncRNAs不仅作为促进肿瘤形成的原癌基因,而且作为抑制肿瘤细胞增殖和迁移的抑癌基因。lncRNA GAS5的下调发生在多种癌症中,包括乳腺癌、结直肠癌、胃癌、胶质瘤、骨肉瘤等[11-13]。有研究表明lncRNA GAS5过表达可以通过结合miRNA,调节miRNA的释放抑制多种肿瘤的进展,包括在乳腺癌中结合miR-23a 促进肿瘤的自噬[6],在结肠癌中结合miR-182-5p抑制结肠癌细胞的增殖并促进细胞凋亡[14],在胃癌中结合miR-222通过PTEN/Akt/mTOR 信号传导调节 GC 细胞增殖[15],在神经胶质瘤细胞中通过直接靶向结合 miR-222抑制细胞增殖、迁移和侵袭,发挥抗肿瘤作用[16]。以上研究表明,GAS5/miRNAs可能在多种肿瘤的预后治疗中发挥作用,但GAS5/miRNAs在PitNETs中的表达和功能的研究报道较少。有研究表明lncRNA GAS5通过miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT通路抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭[5]。而PI3K/AKT信号通路在垂体肿瘤自噬中发挥作用[7]。lncRNA GAS5/miR-23a-3p能否在PitNETs中发挥作用的报道仍较少,为此我们展开相关研究。

lncRNA 的作用机制非常复杂,其中内源竞争RNA 是lncRNA在细胞质中最常见的作用方式。 lncRNAs携带某些 miRNAs 的种子序列,这些 miRNAs内源竞争吸附miRNAs,并阻止 miRNAs 与靶基因结合[17-18]。本研究首先通过starbase数据网站预测miR-23a-3p与GAS5基因的保守结合位点。为了进一步验证GAS5与miR-23a-3p在PitNET细胞的关系,本研究采用双荧光素酶报告基因实验,结果显示miR-23a-3p mimic显着降低了wt-GAS5载体的荧光素酶活性,但未能改变mut-GAS5载体的荧光素酶活性,提示GAS5可能通过调控miR-23a-3p的表达释放发挥调控作用。还有研究报道,在PitNETs的肿瘤发生和进展过程中,lncRNAs内源竞争吸附miRNAs[19]。lncRNA CLRN1-AS1内源竞争吸附miR-217以促进dickkopf WNT信号通路抑制剂1(DKK1)并调节垂体催乳素瘤的细胞活性[20]。还有许多研究证实miRNA在PitNETs肿瘤发生和进展中起着作用[21]。miR-27a-5p显示在前列腺组织中显着下调,伴随异常的启动子甲基化,而其在PC3细胞中的过表达抑制细胞生长,表明miR-27a-5p具有肿瘤抑制作用[22]。本研究的结果提供证据,证明通过RIP检测显示lncRNA GAS5和miR-23a-3p在Ago2颗粒比较有明显差异,在anti-IgG颗粒比较没有差异,进一步证明在PitNET细胞中miR-27a-5p 是lncRNA GAS5的直接下游靶标。在此,lncRNA GAS5在 PitNET细胞中的过表达降低了miR27a-5p的表达,从而抑制了增殖,导致PitNET细胞的G0/G1期细胞周期停滞和凋亡。

而槲皮素作为一种黄酮类化合物,在肿瘤学中具有很高的潜力。槲皮素的抗癌作用依赖于其通过调节细胞周期蛋白、促凋亡、PI3K/Akt和MAPK分子途径来减少增殖、诱导细胞凋亡、导致细胞周期停滞和抑制有丝分裂过程的能力。有研究表明40 μmol/L的槲皮素可以明显增加GAS5的表达[23]。在本研究中,40 μmol/L的槲皮干预组较对照组可以明显抑制RC-4B/C细胞的增殖和侵袭,促进GAS5的表达,抑制miR-23a-3p表达水平。当si-GAS5转染入RC-4B/C细胞后,与正常对照组和阴性对照组相比,GAS5的表达水平降低,miR-23a-3p表达水平升高,RC-4B/C细胞的增殖和侵袭增加。而再加入40 μmol/L的槲皮素后,可以逆转si-GAS5对GAS5的沉默作用,提高GAS5的表达,抑制miR-23a-3p表达,抑制RC-4B/C细胞的增殖和侵袭。上述研究结果在一定程度上说明槲皮素可能通过GAS5/miR-23a-3p调控RC-4B/C细胞的增殖和侵袭。本研究的不足之处是缺乏临床试验,仅从理论分析和细胞实验得出结论,而且关于GAS5/miR-23a-3p作用于PitNETs的研究较少,因此未来仍然需要进一步研究证实。

综上所述,槲皮素可以抑制PitNETs细胞系RC-4B/C的增殖和侵袭,可能是通过促进GAS5表达抑制miR-23a-3p及PI3K/AKT信号通路的作用,沉默GAS5可促进RC-4B/C细胞的增殖和侵袭,而槲皮素的干预可以逆转沉默GAS5的作用。其可能的机制是槲皮素通过靶向GAS5/miR-23a-3p抑制PitNETs细胞增殖和侵袭,GAS5/miR-23a-3p可能是潜在的治疗靶点,该结果为PitNETs的临床诊疗提供了新的方向。