载脂蛋白AⅡ基因-265T/C多态性与冠心病患者脂类代谢及冠脉狭窄程度相关性研究

金银浩,刘桂清

(1.锦州医科大学齐齐哈尔医学院附属第一医院研究生培养基地,黑龙江 齐齐哈尔161041;2.齐齐哈尔医学院附属第一医院,黑龙江 齐齐哈尔161041)

冠心病(Coronary heart disease,CHD)属于心血管内科较为常见的一种疾病,主要是指因冠状动脉粥样硬化病变引起血管腔狭窄或阻塞,继而导致的一组以心肌缺血、缺氧和坏死为主要表现的心脏病[1]。随着近年来高通量测序水平的飞速发展,加之对ApoAⅡ编码基因的表达调控及多态性研究的日益深入,有学者发现ApoAⅡ-265T/C基因位点的多态性具有潜在抗动脉粥样硬化作用,然而该基因对机体脂类代谢的具体调控作用以及和冠状动脉狭窄程度的相关性尚未彻底阐明[2]。鉴于此,本文通过研究ApoAⅡ-265T/C多态性与CHD患者脂类代谢及冠脉狭窄程度相关性,以期为CHD的诊治提供新的靶点,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择医院从2022年4月至10月收治的96例CHD患者,记作研究组。其中男50例,女46例,年龄42～80岁,平均(62.35±10.32)岁;体重55～92 kg,平均(70.32±8.54)kg。另取同期健康体检者100例作为对照组。其中男52例,女48例,年龄40～80岁,平均(61.85±9.85)岁,平均(10.25±3.21)岁;体重53～94 kg,平均(70.50±8.86)kg。各组上述一般资料无统计学差异(均P>0.05),具有可比性。病例纳入标准[3]:①所有CHD患者均符合新版美国心脏病学会(ACC)/美国心脏病协会(AHA)指南制定CHD诊断标准;②均经冠脉造影检查确诊;③年龄>18周岁;④入组前14 d内尚未接受任何药物治疗。排除标准:①合并重大感染或免疫系统疾病者;②伴有重大脏器功能不全者;③既往有心脏手术史者;④合并恶性肿瘤者。入组人员已在知情同意书上签字,医院的伦理委员会已核准。

1.2 研究方法

1.2.1 样本获取及处理:采集研究组入院后翌日清晨空腹静脉血以及对照组入院当天空腹静脉血8 ml,分装为3、5 ml/管,前者保存至-20 ℃冰箱中备用,用以ApoAⅡ-265T/C基因多态性检测。后者则于抽血后2 h进行离心处理,离心条件为3000 rpm,时长为10 min,获取血清用作脂代谢指标和ApoAⅠ、ApoB水平的测定。

1.2.2 ApoAⅡ-265T/C基因多态性检测:置于添加有乙二胺四乙酸和三钾盐(EDTA-K3)的抗凝真空试管中,以3000 r/min离心5 min,留取中间白细胞层,约150 μl,加入等体积超纯水后混匀,后加入与混匀后体积相等的NaI溶液6 mol/L,旋涡15 s,再加入与前面液体混合后的等体积氯仿:异丙醇(24∶1)旋涡混匀,以12000 r/min离心10 min,留取上层液体,加入异丙醇后静置10 min,再次12000 r/min离心10 min,保留下层沉淀,获得基因组DNA。获取的基因组DNA加入37%异丙醇沉淀,室温下晾干后加入TE溶液,保存于-20 ℃。将带有TE溶解液基因组的DNA加入蒸馏水1 ml混匀,以紫外分光光度计上测定260、280 nm处吸光度。设计DNA引物序列,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,正向引物:5’-CTAGGGTTGATATGTCAGAGC-3’,反向引物:5’-TCAGGTGACAGGGACTATGG-3’,将干粉形式引物以超速离心机3000 r/min离心3 min后,设定反应体系:超纯水12.5 μl,10×Buffer 5 μl,MgCl22 μl,dNTPs 1 μl,正反向引物各2 μl,模板DNA 4 μl,Taq酶0.5 μl,ddH2O 1 μl至总体积30 μl;PCR扩增,95 ℃6 min,94 ℃ 25 s,60 ℃ 35 s,72 ℃ 50 s,重复40个循环,再次72 ℃延伸8 min。PCR产物10 μl和限制性内切酶BsmI依次加入0.5 ml Eppendorf管中混匀,65 ℃孵育12 h过夜,保存于4 ℃环境。酶切产物片段以3%琼脂凝胶电泳,DNA样品与10×DNA Loading Bufer按照9∶1比例混合后上样,最后获得273、215 bp和58 bp DNA片段。

1.2.3 生化指标检测:通过7060型全自动生化分析仪及其配套试剂盒完成脂代谢指标的检测,相关指标涵盖甘油三酯(TG),总胆固醇(TC),低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。以免疫透射法检测ApoAⅠ和ApoB,于340 nm波长处进行比色。

1.2.4 冠脉造影:选择桡动脉穿刺,置入导丝与6F动脉鞘管,过程中沿侧管注入普通肝素2500 U。操作过程中一旦遭遇阻力则应撤出导丝,以1∶1比例完成造影剂与0.9%氯化钠溶液的稀释,之后推入造影导管,完成血管解剖形态的观察。

1.2.5 分组方式[4]:所有CHD患者根据Gensini评分的差异分为轻度狭窄组(≤20分)、中度狭窄组(>20分且≤45分)及重度狭窄组(>45分)。评分标准如表1所示。

表1 冠脉造影Gensini评分标准

1.3 评价指标 比较研究组和对照组ApoAⅡ-265T/C基因多态性、血清脂代谢指标水平。分析不同冠脉狭窄程度CHD患者ApoAⅡ-265T/C基因多态性、血清脂代谢指标水平。

2 结 果

2.1 CHD组及对照组脂类代谢指标水平比较 CHD组血清ApoAⅠ及ApoB水平均低于对照组(均P<0.05),见表2。

表2 CHD组及对照组脂类代谢指标水平比较(mmol/L)

2.2 两组ApoAⅡ-265T/C基因多态性比较 ApoAⅡ-265T/C多态性CC+CT基因型频率、C等位基因型频率高对照组,差异有统计学意义(均P<0.05),见表3。

表3 两组ApoAⅡ-265T/C基因多态性比较

2.3 不同冠脉狭窄程度CHD患者的ApoAⅡ-265T/C基因多态性比较 中/重度狭窄组患者的CC+CT基因型频率、C等位基因频率均高于轻度狭窄组,差异有统计学意义(均P<0.05),见表4。

表4 不同冠脉狭窄程度CHD患者的ApoAⅡ-265T/C基因多态性比较

2.4 不同冠脉狭窄程度CHD患者的脂类代谢指标水平比较 中/重度狭窄组血清ApoAⅠ及ApoB水平均低于轻度狭窄组,差异有统计学意义(均P<0.05),见表5。

表5 不同冠脉狭窄程度CHD患者的脂类代谢指标水平比较(mmol/L)

2.5 CHD患者冠脉狭窄程度影响因素的多因素Logistic回归分析 以CHD患者冠脉狭窄程度为因变量,赋值如下:轻度狭窄=0,中/重度狭窄=1。以血清ApoAⅠ、ApoB水平以及ApoAⅡ-265T/C基因多态性为自变量,赋值如下:以血清ApoAⅠ、ApoB水平均为原值输入;CC+CT基因型频率=1,非CC+CT基因型频率=0;C等位基因型=1,非C等位基因型=0。经多因素Logistic回归分析发现,CC+CT基因型频率以及C等位基因型均是CHD患者冠脉中/重度狭窄的危险因素(均P<0.05),见表6。

表6 CHD患者冠脉狭窄程度影响因素多因素Logistic回归分析

3 讨 论

CHD主要包括缺血性心力衰竭、心绞痛、心肌梗死以及猝死等类型,血脂代谢紊乱是CHD的重要危险因素之一,主要包括TG、TC、LDL-C的升高及HDL-C的降低[5]。TG、TC等水平升高可促进LDL-C为主的脂质颗粒沉积于动脉血管内膜内皮下并形成脂质堆积,而HDL-C的下降增加了将胆固醇运转至肝脏排泄的难度,且对机体的抗炎、抗氧化作用降低,从而促进斑块形成,堵塞血管管腔,导致血管狭窄,斑块破裂后形成血栓,造成管腔堵塞,最终引发CHD相关疾病[6]。Apo属于HDL的重要组成部分之一,有研究表明,Apo对血脂代谢以及利用均会产生一定的影响,继而介导高脂血症、CHD及心脑血管疾病的发生和发展[7]。ApoAⅡ是HDL颗粒中的主要载脂蛋白之一,能够维持HDL的结构,且可通过水解乳糜微粒(CM)和极低密度脂蛋白(VLDL)中的TG和磷脂(PL),抑制卵磷脂-胆固醇乙酰转移酶(LCAT)活性,激活肝脂酶[8],故此ApoAⅡ与心血管疾病的相关研究成为热点。

本文结果发现,CHD组血清ApoAⅠ及ApoB水平均低于对照组。这提示了CHD患者血清ApoAⅠ及ApoB水平存在明显的下调。考虑原因,ApoAⅠ属于HDL重要载脂蛋白之一,于HDL成熟以及胆固醇逆回转运过程中起着至关重要的作用,HDL又可抑制动脉壁平滑肌细胞对LDL-C的摄取,进一步避免胆固醇在细胞内的大量堆积[9]。ApoB属于LDL的重要载脂蛋白,其可识别广泛分布在肝、动脉壁细胞等组织细胞表面的LDL受体,进一步影响机体脂代谢,间接参与CHD的发生、发展过程[10-12]。此外,ApoAⅡ-265T/C多态性CC+CT基因型频率、C等位基因型频率高对照组,差异有统计学意义。这反映了CHD患者ApoAⅡ-265T/C多态性相较于正常健康者有明显差异。究其原因,ApoAⅡ-265T/C基因会通过对ApoAⅠ的表达进行调控,进一步对下游HDL的代谢产生影响。然而,但ApoAⅡ-265T/C基因型朝C等位基因型方向偏移时,其对ApoAⅠ的表达调控作用赫然发生变化,可能促使其原本调节HDL代谢的作用减弱甚至丧失,从而引起HDL代谢异常的发生,从而促进了CHD的发生、发展[13-15]。另外,中/重度狭窄组患者的CC+CT基因型频率、C等位基因频率均高于轻度狭窄组,差异有统计学意义。分析原因,随着ApoAⅡ-265T/C基因CC+CT基因型频率的增加,该基因对HDL代谢相关基因的调控能力异常,间接导致了HDL的代谢异常,从而使得HDL-C水平降低,致使其抗动脉粥样硬化作用减弱,促进了病情的进展[16-18]。同时,中/重度狭窄组血清ApoAⅠ及ApoB水平均低于轻度狭窄组。其中主要原因,可能是ApoAⅠ及ApoB表达的降低会导致两者功能发生改变,进一步影响HDL的代谢,使得机体血脂代谢以及利用发生异常,介导了CHD的发生、发展[19-20]。经多因素Logistic回归分析发现,CC+CT基因型频率以及C等位基因型均是CHD患者冠脉中/重度狭窄的危险因素。这充分说明了ApoAⅡ-265T/C多态性和CHD患者冠脉狭窄程度有关,值得临床关注。

综上所述,CHD患者存在ApoAⅡ-265T/C基因CC+CT基因型频率以及C等位基因型频率较高的特点,均和CHD患者中/重度狭窄有关。