白细胞介素-6-572C-G基因多态性与小儿复杂型热性惊厥及症状发作后脑损伤关系临床研究

武文娟,韩 伟

(陕西省人民医院儿童病院,陕西 西安 710068)

热性惊厥(Febrile convulsion,FS)是好发于6个月至5岁儿童的神经内科疾病,病情容易反复,其中复杂型FS(Complex FS,CFS)是小儿热性惊厥的严重类型,其相较于单纯型FS,惊厥发作频率增多,持续时间延长,故患儿脑组织损伤风险更高[1],患儿可能会转变为癫痫,甚至出现智力低下或行为及异常等脑损伤性疾病[2]。影响CFS发作后脑损伤因素较多且复杂,目前关于其机制尚未十分明确。以往在小儿FS发病机制探究中发现,FS发生除与遗传因素有关外,还与机体免疫炎症反应异常有关[3]。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)是人类遗传变异中最常见类型,临床被报与多种疾病发生、发展和转归密切相关[4-5]。白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)是临床研究较多的与小儿FS发生有关习惯的细胞因子,目前研究已明确其上调及其基因多态性与FS发生有关[6-7]。然而,以往针对IL-6基因多态性分析的研究对象多为FS[3,7],尚缺少IL-6-572C-G基因多态性与具体CFS发生及发作后脑损伤关系的数据报道。鉴于此,本研究对IL-6-572C-G基因多态性与小儿CFS及发作后脑损伤的相关性进行分析,以期为此类患儿诊疗及预后改善提供更为科学的依据,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2020年3月至2022年12月在本院接受诊治的FS患儿150例为研究对象,其中62例为单纯型FS(单纯组),88例为CFS(复杂组)。病例纳入标准:首次发病;符合《热性惊厥诊断治疗与管理专家共识(2016)》中有关FS的诊断标准[8];获得患儿监护人和自身同意,并签署知情协议书。排除标准:其他类型惊厥;伴有颅脑实质性损伤或其他可能引发脑损伤性疾病;合并其他严重基础性疾病;合并血液系统疾病。同时收集在儿保科接受健康体检且显示各项功能指标正常的50例儿童作为对照组。单纯组男孩30例,女孩32例;年龄5个月至6岁,平均(2.80±0.81)岁;病程2～7 d,平均(3.00±0.98)d;体温37.7～40.8 ℃,平均(38.79±1.18)℃;发热原因:上呼吸道感染41例,急性胃肠炎8例,中毒性菌痢3例,其他10例。复杂组男孩44例,女孩44例;年龄6个月至7岁,平均(2.84±0.81)岁;病程1～6d,平均(2.77±0.92)d;体温37.5～41.5 ℃,平均(38.80±1.29)℃;发热原因:上呼吸道感染60例,急性胃肠炎11例,中毒性菌痢2例,其他15例。对照组男孩26例,女孩24例;年龄5个月至6岁,平均(2.84±0.84)岁。三组受试儿上述基线资料间比较差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 研究方法 收集三组受试儿肘静脉血样1～2 ml,置入内含乙二胺四乙酸的抗凝管中,离心分离血浆,剩余血细胞中加入人红细胞裂解液,震荡混匀3 min,再次离心,弃上清液,留白细胞沉淀,-80 ℃冷藏待用。①DNA提取:赛默飞提供的DNA zol试剂提取受试儿基因组DNA。②目标标DNA扩增:Thermofisher ABI 7500实时荧光定量PCR仪对DNA进行扩增,引物序列(正向引物:5’-GGAGACGCCTTGAAGTAACTGC-3’,反向引物:5’-GAGTTTCCTCTGACTCCATCGCAG-3’)由上海生物工程公司提供;反应体系:模板DNA 1 μl、dNTP (10 mmol/L)1 μl、正反向引物(20 μmol/L)各1 μl、10×Bueffer缓冲液3 μl、TaqDNA聚合酶1.5 μg、MgCl2(1.5 mmol/L)3 μl,灭菌去离子定容至30 μl;反应条件:94 ℃预变性10 min,变性60 s,65 ℃退火60 s,72 ℃延伸90 s,35个循环后,72 ℃条件下再次延伸10 min。③目标DNA分离测定:取10 μl PCR产物实施琼脂糖凝胶电泳,电泳后凝胶置于0.5 μg/ml溴乙锭中染色,SDS 2.4软件分析目标基因分型,酶切条带为163 bp=C/C基因型,163、101、62 bp=C/G基因型,101、62 bp=G/G基因型[9]。

1.3 观察指标 ①比较三组的IL-6基因多态性;②统计复杂组患儿发作后脑损伤情况,即高热惊厥期间和体温正常14 d后患儿脑电图均明显异常,惊厥后伴神经症状或癫痫发作,比较脑损伤和无脑损伤患儿性别、年龄、病程、发热体温、抽搐持续时间、发热原因、抽搐范围、血清IL-6水平和IL-6基因型频率;③分析影响CFS患儿发作后脑损伤发生的危险因素。

1.4 统计学方法 采用 SPSS 22.0统计学软件进行分析。计量资料以(均数±标准差)表示,组间比较用单因素方差分析,两间比较用t检验,不符合正态分布[M(Q1,Q3)]Mann-WhitneyU检验;计数资料以[例(%)]表示,组间比较用χ2检验;危险因素分析用Logistic回归分析;P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 三组IL-6基因多态性分布比较 三组IL-6基因CC、CG、GG频率和等位基因C和G表达频率间比价差异具有统计学意义(均P<0.05),复杂组CC基因型频率和C等位基因频率明显低于单纯组,单纯组明显低于对照组(均P<0.05),复杂组GG基因型频率和G等位基因频率高于单纯组,单纯组高于对照组(均P<0.05),复杂组和单纯组CG基因型频率均高于对照组(均P<0.05)。见表1。

表1 三组IL-6基因多态性分布比较[例(%)]

2.2 复杂组脑损伤组与无脑损伤者组IL-6基因多态性分布比较 见表2。复杂组发作后脑损伤患儿CC基因型频率和C等位基因频率明显低于无脑损伤者,GG基因型频率和G等位基因频率高于无脑损伤者(均P<0.05)。

表2 复杂组脑损伤组与无脑损伤者组IL-6基因多态性分布比较[例(%)]

2.3 复杂组脑损伤组与无脑损伤者组一般资料比较 复杂组发作后无脑损伤患儿与脑损伤患儿男孩、年龄、病程、发热体温、发热原因分布情况间比较差异均无统计学意义(均P>0.05),发作后脑损伤患儿抽搐持续时间>15 min者、全身抽搐占比和血清IL-6水平均明显高于无脑损伤患儿(均P<0.05)。见表3。

表3 复杂组脑损伤组与无脑损伤者组一般资料比较

2.4 影响CFS发作后脑损伤的危险因素 以是否出现发作后脑损伤为因变量Y(赋值:否=0,是=1),抽搐持续时间、抽搐范围、血清IL-6水平和IL-6基因多态性为自变量X(赋值:抽搐持续时间<15 min记0,≥15 min记1;抽搐范围局部记0,全身记1,IL-6基因多态性CC记0,CG+GG记1,血清IL-6原值带入),进行Logistic回归分析。结果显示,抽搐持续时间≥15 min、全身抽搐、IL-6基因型CG+GG和IL-6水平升高均是患儿发作后脑损伤形成的危险因素(均P<0.05)。见表4。

表4 影响CFS发作后脑损伤的Logistic回归分析

3 讨 论

小儿CFS起病急,抽搐时间长,抽搐次数频繁,发作后脑损伤风险较单纯FS高,导致后续治疗难度增加[10]。目前,虽已有较多关于FS的研究[5,7],但对于CFS发病和发作后脑损伤形成机制尚未完全明确。发热是FS所共有的病理基础,IL-6、TNF-α等多种炎症介质在发热中扮演重要角色。以往众多研究证实,FS脑脊液和外周血中IL-6水平显著高于发热对照组和健康对照组[6,11],同时其发病与IL-6相应SNP亦存在相关性[12]。刘占国等[13]在脓毒症病情进展机制研究中显示,中枢神经损伤亦与血清IL-6有关,后者可作为脓毒症性脑损伤动态监测的潜在标志物。陈文园[14]提出,IL-6表达水平监测可能有助于在早期区分单纯型FS与CFS。

既往研究指出,亚洲人群中,IL-6-572C-G中以C等位基因占主导地位[15],而G等位基因则常见于高加索居民中[16]。本研究对比显示,与健康对照小儿比较,CFS、单纯型FS患儿IL-6的CC基因型和C等位基因频率均明显下降,GG基因型和G等位基因频率均明显升高,与杨跃萍、李珍等报道结果存在相似性[3-7]。同时,CFS与单纯型FS患儿IL-6相应基因型和等位基因频率亦存在明显差异(均P<0.05)。提示G等位基因表达可能是FS发生的易感基因,更是CFS发生发展的易感基因。分析原因可能与携带G等位基因的基因位点IL-6启动子活性强,转录活性高,导致机体炎症反应增强,大脑温度升高[17];此外,炎症反应增强会对机体免疫防御机制造成损伤,增加患儿感染风险,引起感染后发热,这些均会增加CFS危险性[18]。

长时程惊厥和持续性全身抽搐可引起短暂或长期大脑功能障碍,产生神经中枢后遗症[18]。CFS较单纯FS患儿病情更为凶险,患儿更易出现发作后脑损伤,严重影响小儿生长发育,导致其学习能力下降。IL-6属于细胞信号分子,主要由T细胞分泌,可刺激B细胞释放免疫球蛋白和其他炎症介质释放。张玉松等[11]在FS大鼠海马组织中发现IL-6上调表达,IL-6启动子区域甲基化水平下降。Gallentined等[19]研究显示,在FS持续所致脑损伤预测方面,IL-6价值高于IL-1β。本研究对比显示,与无脑损伤者比较,CFS发作后脑损伤患儿CC基因型频率和C等位基因频率明显下降,而GG基因型频率和G等位基因频率明显升高,CG+GG基因型表达是患儿发作后脑损伤形成的危险因素之一(均P<0.05),与Azab等[12]报道结果相似。分析原因,脑损伤形成和发展与机体免疫炎症反应等有关。IL-6、肿瘤坏死因子-α等是大脑某些刺激作用下所释放的强有力的致热源,可影响神经元兴奋性[20-21]。G等位基因出现,导致IL-6启动子区域去甲基化,IL-6基因大量转录反应,积累释放的IL-6及其刺激活化的其他炎症细胞和介质会造成炎症反应级联放大,引起大脑神经异常放电,从而增加脑损伤风险。

综上所述,CFS患儿IL-6基因型表达状态不同于单纯型FS,等位基因由正常的C为主转变为G为主,且CG+GG基因型上调表达与发作后脑损伤形成有关,是CFS发作后脑损伤形成的危险因素之一。