大豆种质资源萌发期耐盐性评价和耐盐机理解析

王萌，刘文君，鲁雪莉，陈庆山，杨明亮，吕波，徐宗昌

（1青岛农业大学农学院，山东青岛 266109；2河北科技师范学院海洋资源与环境学院，河北秦皇岛 066044；3中国农业科学院烟草研究所海洋农业研究中心，山东青岛 266100；4青岛市滨海盐碱地资源挖掘与生物育种重点实验室，山东青岛 266100；5东北农业大学农学院，哈尔滨 150000；6山东农业大学生命科学学院，山东泰安 271018）

0 引言

土壤盐渍化是制约农业生产的世界性难题，目前全球超过100 个国家耕地受到土壤盐渍化影响，盐渍化土壤面积占可耕地面积的1/3 左右[1]。中国土壤盐渍化面积约占世界总面积的1/10，是土地盐渍化面积的第三大国[2]。盐害胁迫对农作物生长造成的影响主要包括两个方面，一是土壤盐溶液浓度增加造成土壤渗透势增高从而导致植物根系细胞吸水困难，形成生理干旱；二是钠离子大量进入胞内造成钾钠比例失调，产生离子毒害作用，造成农作物生长发育减缓和减产，盐害如果超过植物的耐受阈值就会导致植物萎蔫和死亡，造成绝产[3]。筛选和培育耐盐碱作物品种是减少盐渍化土地对植物生长抑制的有效方法之一[4]，也是从“由地适种”到“由种适地”理念转变的具体实践。

很多研究表明栽培大豆(Glycine max)是中度耐盐作物，能够耐受的土壤盐度阈值上限为5 ds/m[5-6]，筛选耐盐能力更强的大豆种质资源是在盐渍化土地进行生产的前提，因此大豆耐盐种质资源的筛选和鉴定也是一个研究热点领域。邵桂花等[7]采用地下咸水在室内和大田对近2000 个大豆品种进行了全生育期耐盐鉴定，最终筛选到7个全生育期耐盐品种，出苗期耐盐品种242个，苗期85个，花荚期82个。张彦威等[8]通过盆栽和大田实验对161份黄淮海地区主栽大豆品种进行出苗期、苗期和田间耐盐性鉴定，最终筛选到35 份苗期耐盐资源；通过进一步的耐盐性鉴定和大田生产试验，最终获得8 份生产表现良好的种质资源。姜奇彦等[9]使用1.2% NaCl 溶液在室内对793 份大豆种质资源进行芽期耐盐性鉴定，筛选到出芽期和苗期耐盐种质资源117 份和41 份，再经大田筛选鉴定后获得全生育期耐盐种质资源35 份。刘谢香等[10]通过耐盐指数评价方法从27 份大豆种质资源中鉴定到出苗期高度耐盐大豆种质3份。这些研究表明不同基因型大豆种质资源耐盐能力具有差异性，同一个种质资源在不同生长发育时期耐盐性也不相同，因此大豆的“中度耐盐”只是一个相对概念，要在盐渍化土地上进行大豆生产，耐盐性种质资源的筛选和鉴定是必要的。

虽然萌发期和全生育期的耐盐性没有非常显著的关联性，但是萌发是农作物生长的第一个步骤，也是最先面临盐胁迫的生育时期。大豆的萌发期和苗期相对于其它时期对盐胁迫更加敏感[11]，因此萌发期耐盐能力是大豆在盐碱地上生长和获得高产的必备特征，研究萌发期大豆种质资源的耐盐性，是筛选盐碱地适生大豆种质资源的重要工作。本试验旨在通过设置不同NaCl浓度对大豆萌发期多个指标进行测定，综合评价大豆种质资源的耐盐能力，以期为大豆耐盐品种改良和盐碱地引种提供优质种质资源。

1 材料与方法

1.1 材料

试验大豆种质资源52份（表1），其中50份由东北农业大学杨明亮老师提供，另有2 份购自富宜春种子公司，用于室内萌发期和苗期耐盐性鉴定。

表1 试验用52份大豆种质资源及综合评价结果

续表1

1.2 试验设计

试验于2022 年4 月—8 月在中国农业科学院烟草研究所青岛市滨海盐碱地资源挖掘与生物育种重点实验室和青岛农业大学农学院山东省旱作农业技术重点实验室进行。种子萌发试验设置0.4%和0.8%两个NaCl 处理，不加NaCl 作为对照。实验用种挑选籽粒饱满大小一致无明显病斑的种子，按照GBT 5520—2011粮油检验发芽试验要求，每个处理设置3个重复，每个重复使用50 粒种子进行萌发实验。发芽基质参考刘谢香等[10]采用蛭石，在苗盘中先铺4 cm左右厚的蛭石，然后均匀的铺上种子，再覆盖蛭石1 cm左右，从苗盘下面浇透后盖上塑料盖子保湿，置于培养间内培养（25℃，光周期为8 h黑暗16 h光照）。分别于第4天和第7天统计发芽势和发芽率以及下胚轴长和粗。选取的耐盐和不耐盐植株按照上述方法培养，于第10天开展幼苗表型统计和各种生理指标测试。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 萌发期和苗期测定指标与方法 根据GBT 5520—2011 粮油检验发芽试验要求，在第4 天和第7天分别统计各种质资源的发芽势和发芽率。在第4、7和10 天时将处理和对照的种质拍照，使用Image J 软件统计下胚轴长和粗，下胚轴粗以距蛭石表面1 cm处为准，每个处理统计10个单株。相对指标计算方法见公式(1)。

其中为NaCl处理各指标的平均值，为对照各指标平均值。

1.3.2 叶绿素含量测定方法叶绿素含量参照邹平[12]的方法进行测定。

1.3.3 叶片相对含水量叶片相对含水量参照邹平[12]的方法进行测定。

1.3.4 抗氧化酶SOD 活性测定方法抗氧化酶SOD 活性参照WANG等[13]的方法测定。

1.3.5 Na+含量测定方法Na+含量参照WANG等[13]的方法测定。

1.4 耐盐指标综合评价方法

1.4.1 隶属函数评价方法采用隶属函数法对大豆种质萌发期耐盐性进行综合评价，参照李玲等[14]的方法计算隶属函数值，公式见式(2)～(3)。

式中Xij表示某一种质资源某个具体指标的实测值，Xjmax表示该指标在种质群体内的最大值，Xjmin表示该指标在种质群体内的最小值；U(Xij)表示i种质j性状的隶属值；Xi表示i种质的平均隶属值，n表示测定的指标个数；其中Xi值越大表明该种质资源的耐盐性越强。参照张彦威等[15]的方法，将大豆耐盐性按照隶属函数值划分为4 个耐盐级别：0.75≤Xi≤1，高耐盐；0.50≤Xi＜0.75，耐盐；0.25≤Xi＜0.50，中间型；0≤Xi＜0.25，不耐盐。1.4.2 聚类分析评价方法采用Cluster 3.0软件对种质资源的各个指标进行聚类分析。

1.5 数据统计

使用Excel 对数据进行平均值、标准差和变异系数等分析，使用SPSS 16.0对数据进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度盐胁迫对种质资源群体萌发和苗期指标的影响

与对照组相比，盐胁迫对大豆群体萌发期和苗期指标的影响主要体现在两方面：一是各个指标基本呈显著下降态势，二是指标在群体内的波动范围变大，并且盐浓度越高这种趋势就越明显（图1）。0.4%NaCl胁迫下，群体平均发芽势和发芽率两个指标与对照相比没有显著性差异，但在0.8%NaCl 胁迫下这两个指标显著下降，与对照相比降幅分别为12.47%和6.23%，最低发芽势和发芽率分别为53.33%和66.67%（图1A，B）。这说明中浓度盐胁迫对大豆萌发影响不大，但随着盐度的增加不同种质资源的发芽势和发芽率表现出了明显的差异。0.4%和0.8%NaCl胁迫4 d时，平均下胚轴长度较对照分别下降了37.03%和74.34%，平均粗度则分别下降了7.14%和44.92%，说明盐胁迫会严重抑制大豆的生长，对下胚轴长度的影响程度要高于其粗度（图1C，D）。7 d 时下胚轴长度（平均长度降幅分别为20.00%和56.28%）与粗度（平均降幅为4.92%和8.63%）（图1E，F）以及10 d 时幼苗株高（平均降幅为17.69%和47.41%）（图1G）结果与4 d 时类似，大豆资源的发芽指标受到盐胁迫的显著抑制。

图1 大豆种质资源群体在不同浓度NaCl胁迫下的指标分布情况

2.2 盐胁迫在个体水平对萌发和苗期指标的影响

如表2所示，除0.4%NaCl胁迫下10 d幼苗高度和0.8%NaCl 胁迫下4 d 和7 d 下胚轴长度这3 个指标所有个体均受到抑制外，其余5 个指标均存在盐胁迫高于对照的个体。在0.4% NaCl 胁迫下，相对发芽势(RGE)、相对发芽率(RGR)、4 d 相对下胚轴长度(4DRHL)和粗度(4D-RHC)以及7 d 相对下胚轴长度(7DRHL)和粗度(7D-RHC)最大值分别较对照提高10%、11%、14%、7%、10%和6%；7 d下胚轴粗度受盐胁迫促进的个体最多，占比21.15%，其次为发芽势和发芽率，占比均为19.23%。而在0.8% NaCl 胁迫下，RGE、RGR、4D-RHC、7D-RHC 以及10 d 幼苗高度(10DRPH)的最大值分别较对照提高14%、13%、6%、7%和14%；发芽势受盐胁迫促进的个体最多，占比9.62%，其次为发芽率和7 d下胚轴粗度，占比均为7.69%。这说明资源个体的萌发生长在受到盐胁迫后呈现分化，盐胁迫作为一种刺激因素能够促进一些种质的萌发或者生长，这种促进作用会随着盐胁迫程度的增加而降低。

表2 52份大豆种质资源萌发期和幼苗期盐胁迫下各指标相对值比较

在0.4%NaCl胁迫下，4 d下胚轴长度的变异系数最大，为28.23%，其次是7 d下胚轴长度和10 d幼苗高度，分别为16.05%和9.88%；而在0.8% NaCl 胁迫时，也是4 d下胚轴长度的变异系数最大，为91.20%，其次是4 d下胚轴粗度和7 d下胚轴长度，分别为80.98%和38.25%。这说明下胚轴的发育对盐胁迫的响应较为敏感。

2.3 隶属函数耐盐性综合评价

根据平均隶属值的耐盐等级划分标准，筛选获得耐盐种质18 份，占供试种质资源的34.62%，耐盐性最好的种质资源为Gm046(L62-904)，平均隶属值为0.7407；中间型种质资源23 份，占供试种质资源的44.23%；不耐盐种质资源11 份，占供试种质资源的21.15%，耐盐性最差的种质资源为Gm043(J-766)，平均隶属值为0.1446（表1）。未鉴定到高耐盐种质资源。

2.4 耐盐性聚类分析

从图2 可以看出，52 份大豆种质资源很明显的分成了3个类群。类群II包括14份耐盐种质资源和4份中间型种质资源，类群III包括14份中间型种质资源和2份耐盐种质资源；11份不耐盐的种质资源都聚类到了类群I的a和c分支中，b分支则聚类了5个中间型种质资源和2个耐盐种质资源。聚类结果与隶属函数综合评价的结果基本一致，反应了耐盐评价结果的准确性。

图2 52份大豆品种的耐盐性聚类分析图

2.5 耐盐和不耐盐品种指标对比

为了进一步解析耐盐和不耐盐大豆种质资源的生理差异，在耐盐和不耐盐的资源中各随机挑选3 个种质开展生长和生理指标的检测。结果表明不耐盐大豆种质资源的株高受盐胁迫抑制较为严重，在0.4%和0.8% NaCl 胁迫下，相对株高分别降低了15.43%和37.00%；而耐盐种质资源的相对株高在0.4%NaCl 胁迫下仅下降6.08%，在0.8% NaCl 胁迫下下降幅度为28.76%（图3A）。在0.4%和0.8%NaCl胁迫下，不耐盐种质资源的相对根长分别下降了18.39%和35.97%，而耐盐种质资源的降幅分别为3.96%和27.98%。值得注意的是，在0.4%NaCl 胁迫下Gm050 的相对根长提高了14.48%，但统计结果表明差异不显著（图3B）。笔者发现不耐盐品种Gm022 和Gm024 在正常生长条件下叶绿素含量要比3 个耐盐品种高，但是受到盐胁迫之后不耐盐种质资源的平均叶绿素含量要比耐盐种质资源分别低5.20%（0.4%NaCl）和4.48%（0.8%NaCl）（图3C），这说明叶绿素含量对提高大豆的耐盐能力具有重要作用。叶片相对含水量是衡量植物耐逆性的一个重要指标，在盐胁迫条件下，耐盐种质资源的叶片相对含水量与对照相比变化不大，但是不耐盐种质资源的叶片相对含水量在0.4%和0.8%NaCl胁迫下分别下降了28.39%和29.35%（图3D）。在盐胁迫条件下，耐盐种质材料的SOD 活性与对照没有显著差异，但是在0.8%NaCl胁迫下3个不耐盐材料的SOD活性较对照分别下降42.32%(Gm002)，37.25%(Gm013)和24.20%(Gm043)（图3E），这既表明了大豆种质资源内在耐盐机制的普遍性，也体现了在个体水平上的差异性。耐盐和不耐盐种质资源的根、茎和叶中Na+含量均呈现出随着盐浓度增加而增加的现象（图3F-H）。无论是耐盐品种还是不耐盐品种，根都是大豆Na+的主要存储器官，其次是茎，叶子中Na+的含量相对较低（图3FH）。在0.4%NaCl胁迫下，不耐盐品种根中的Na+平均含量要比耐盐品种高10.43%，茎中Na+含量则高82.05%；但在0.8%NaCl 胁迫下，耐盐品种根中的Na+平均含量要比不耐盐品种高23.06%，而不耐盐品种茎中的Na+含量则是耐盐品种的1.20倍（图3G，H），这说明不耐盐材料茎中的高Na+含量很可能是抑制地上部分生长的重要原因，其根系的持Na+能力也存在一个阈值，超过这个阈值后Na+便加速向茎中流动，进一步加剧盐害作用。

图3 耐盐和不耐盐种质资源个体生理和生化指标测定

3 讨论与结论

筛选合适的耐盐作物品种在盐碱地上种植是利用盐碱地进行粮食生产的有效途径。栽培大豆是中度耐盐作物，但是盐胁迫依然会抑制大豆地上部分和根的生长，造成产量损失[16-18]。张新草等[19]使用60 mmol/L混合盐碱溶液处理大豆，幼苗长、根长、苗鲜质量和根鲜质量较未处理大豆都有明显的下降。张彦威等[8]将筛选得到的35份苗期耐盐大豆在苗期使用0.5%NaCl溶液连续浇灌6次，共计有27份种质资源出现不同程度的黄化萎蔫现象，植株受盐胁迫影响较大。刘谢香等[10]研究指出使用150 mmol/L NaCl处理大豆幼苗时，其成苗率、株高、地上部鲜重、根鲜重、地上部干重和根干重均显著降低。这些研究结果表明无论使用复合盐还是单一盐，盐胁迫对大豆的生长都会起到抑制作用，所不同的是，耐盐种质资源受到的抑制程度相对较低。本研究的试验也得到了类似的结果，盐胁迫处理的大豆种质其发芽势、发芽率、下胚轴的长度和粗度较对照都显著下降，并且这种下降趋势随着盐浓度的升高也逐渐加大（图1），但是耐盐种质资源较不耐盐种质资源下降程度要小（图3），因此在盐碱地上进行生产，耐盐品种的筛选和鉴定是非常必要的。

作物的耐盐性鉴定包括多个方面，以发育时期划分包括萌发期、苗期、成株期、开花期、产量形成期以及全生育期等；以所用胁迫溶液划分包括地下咸水、稀释海水、单一盐溶液（如NaCl、Na2SO4），以及复合盐溶液等；以开展试验的场所划分主要包括室内和大田两个场景。在实际生产中，萌发是农作物发育的第一步，萌发期耐盐性能够直接决定盐碱地大豆的出苗率，因此萌发期的耐盐鉴定是大豆面向盐碱地生产所必不可少的[5]。相对于大田鉴定，室内鉴定具有通量高、周期短、环境可控，重复性高等特点[9]，因此在室内使用NaCl 溶液进行盐胁迫模拟筛选大豆耐盐种质资源是目前的主流做法，NaCl 溶液浓度的选择一般集中在50～200 mmol/L 之间[8-11,15,20]。罗庆云[21]研究指出，使用50 mmol/L（约0.29%）和100 mmol/L（约0.58%）NaCl溶液进行胁迫试验，所有大豆种质资源均有正常植株生长，但使用150 mmol/L（约0.88%）NaCl 溶液时，处理组大豆不能正常生长发育。在具体浓度选择上，邵桂花等[7]指出进行资源耐盐性鉴定时浓度可低一些，筛选高度耐盐种质资源则可采用高浓度NaCl。一般认为土壤含盐量0.30%和0.60%是轻中度和中重度盐碱地的分界线，并且一般以0.30%做为农作物耐盐与否的阈值线。在本试验中，为了筛选到耐盐能力更为突出的大豆种质资源，我们使用0.40%（约为68.4 mmol/L）和0.80%（约为136.8 mmol/L）两个盐浓度进行试验，最终获得萌发期耐盐种质资源18 份（表1）。盐碱地类型复杂，根据所含优势盐分组成通常分为盐地、碱地以及混合盐碱地[22]。有研究指出，混合盐碱胁迫对植物造成的危害程度要远大于单纯中性盐或碱性盐胁迫[3,23]。因此只使用NaCl做为胁迫处理进行耐盐筛选与鉴定也具有一定的局限性，只有在滨海盐渍土、海水倒灌等土壤盐分组成主要以NaCl为主的地方，筛选结果才有匹配性。在中国西北干旱半干旱区以及东北盐碱区，土壤盐化与碱化往往相伴发生，且土壤盐分组成不尽相同[24]，因此在进行大豆资源耐盐碱鉴定时，还要考虑筛选到的品种是要在哪些产区主栽，以主栽区土壤盐分组成配置合适的胁迫溶液进行耐盐性筛选和鉴定，筛选到的耐盐种质资源才能在主栽区更好的生长[19]。

离子毒害能够扰乱植物体内离子平衡，是盐胁迫影响作物生长的一个关键因素[25]。在本试验中，采用隶属函数综合评价方法对52 份大豆种质资源进行了耐盐性划分，并从中随机挑选了3 株耐盐和不耐盐的种质资源进行苗期生理指标检测，以期解析耐盐品种和不耐盐品种的耐盐性机理。我们特别注意到，在0.8%NaCl胁迫下，耐盐品种根中的Na+平均含量要比不耐盐品种高23.06%（图3G），而不耐盐品种茎中的Na+含量则比耐盐品种高了约1.20倍，茎与根中的Na+含量基本一致（图3H），这说明不耐盐品种根对Na+的约束能力存在一个阈值，超过这个阈值之后Na+便向茎和叶中流动，从而加剧盐害。石广成等[20]的研究表明，在盐胁迫条件下耐盐品种汾豆105、Lee68 根和茎中的Na+和Cl-积累较多，叶片中较少；而盐敏感种质资源陕西八月黄和Jackson 则在叶中积累了较多的Na+，盐敏感材料存在Na+由跟向茎叶转移的现象，这与本研究结果基本一致。大豆是不耐Cl-作物目前已基本没有争议，相对与Na+，Cl-积累能够给大豆的生长造成更大的伤害[26]。但对于只用NaCl 做为胁迫溶液的胁迫处理，Cl-在大豆不同组织中的分布规律与Na+相似[20]，可用Na+来表征大豆盐胁迫危害。刘光宇等[27]在1/2 Hoagland 营养液中添加100 mmol/L 的NaCl 后培养大豆，研究大豆不同组织中Na+含量和耐盐性的关系，结果表明大豆茎、叶和子叶Na+含量与耐盐级别呈极显著正相关，可以用叶片和子叶中Na+含量有效区分苗期耐盐和盐敏感大豆品种。因此，大豆不同组织持Na+能力也是其耐盐性强弱的一个重要体现。

本研究以黄三角NaCl 型盐碱栽培区做为耐盐大豆的主要目标栽培地，采用0.4%和0.8%NaCl 单盐溶液对引进的52份大豆种质资源进行胁迫处理，通过隶属函数综合评价方法进行耐盐性评价，最终获得耐盐种质资源18 份，中间型种质资源23 份以及11 份不耐盐种质资源。耐盐机理研究发现高叶绿素含量、高叶片相对含水量和根中较强的Na+持有能力是耐盐性较强种质的基本特征。