细胞体外共培养模型在中枢神经系统疾病的应用研究进展▲

朱健敏 陈 炜 吴 林

(1 广西中医药大学科学实验中心,广西南宁市 530200;2 广西中医药大学第一附属医院,广西南宁市 530023)

【提要】 细胞间的通讯是正常生理学中不可缺少的活动,但单细胞体外培养模型不能很好地反映人体复杂的细胞通讯活动。细胞体外共培养模型可以通过模拟体内环境,观察不同细胞与细胞之间,以及细胞与胞外环境之间的相互作用,广泛应用于神经退行性疾病的研究。神经炎症引起的神经元损伤与神经退行性疾病发生机制的关系目前尚未完全明确。细胞体外共培养模型可以用于研究特定的炎症分子途径,直观了解大脑细胞之间复杂的相互作用,从而进一步揭示神经细胞与神经胶质细胞之间的串扰机制。本文对不同细胞体外共培养模型在中枢神经系统疾病中的应用研究进行综述,以期为中枢神经系统疾病的基础研究提供参考。

细胞间的通讯活动广泛参与人体的生理及病理过程,如神经递质、生长因子、细胞外囊泡等介导的通讯活动。细胞体外共培养研究证实供体细胞和受体细胞之间存在RNA转移,这为研究肿瘤与脑微环境多细胞串扰机制和肿瘤靶向治疗提供了新思路[1]。神经炎症提示中枢神经系统动态平衡紊乱,是当前神经退行性疾病研究的重点[2],但神经炎症与神经退行性疾病发病机制的关系目前尚未完全明确。可靠的细胞体外共培养模型是临床验证中枢神经系统疾病治疗方法的重要工具。本文就近年来不同细胞体外共培养模型在中枢神经系统疾病中的应用研究进行综述。

1 细胞体外共培养模型

由于单细胞体外培养模型容易受到培养环境的影响而减少原有的生物学特征,故在20世纪80年代,便有学者提出“细胞体外共培养模型”的概念,随后该概念日渐成熟[3]。细胞体外共培养模型是指在同一环境中进行2种或2种以上的细胞培养,根据不同的实验设计目的,可分为直接接触共培养、间接接触共培养等培养模型,还可以细分为直接混合共培养、间接共培养、3D共同培养系统及脑片共培养等培养模型。细胞体外共培养模型可以最大限度地模拟不同细胞之间生物功能信号的相互作用,并促进细胞的定向增殖,建立与体内相似的培养微环境。细胞体外共培养模型的选择取决于细胞之间的黏附状态,其中直接混合共培养模型操作较为简单,且费用较低,但是难以对单一细胞蛋白进行分析,并且其结果的分析和解读较为困难。间接共培养模型指的是将2种以上类型细胞置于不同的环境中,通过培养室、过滤器、凝胶等仪器观察体液因子介导细胞间相互作用,进而研究不同类型细胞活动之间的分子机制。其中Transwell小室共培养模型被视为间接共培养模型的标准化方法[4]。3D共同培养系统可同时培养3种以上的人类细胞,满足参与神经炎症的不同类型细胞间串扰机制的研究需求[5],形成更加接近人体试验的数据,且可以进行较为准确的定量与定位分析,但其费用较为昂贵且操作要求较高。脑片共培养的缺点在于细胞容易氧化坏死,不利于用于长时间的培养研究。

2 细胞体外共培养模型在中枢神经系统疾病中的应用

2.1 细胞体外共培养模型在帕金森病中的应用 帕金森病是一类与年龄相关的神经退行性病变,临床症状以行动迟缓、强直、静止性震颤等运动症状及抑郁、睡眠障碍等非运动症状多见[6]。目前认为其主要发病机制为α-突触核蛋白(α-synuclein,αSYN)聚集、氧化应激与神经炎症,病理特征表现为黑质中多巴胺能神经元的丧失,以及在路易体中天然αSYN丝状聚集[7]。此外,铁离子的沉积会加速αSYN原纤维的类朊蛋白增殖[8],加快帕金森病的进展。

2.1.1 细胞体外共培养模型在帕金森病分子机制研究中的应用:近年来,帕金森病患者脑内铁离子异常沉积进而加重黑质-纹状体系统多巴胺能神经元功能损伤的研究逐渐受到关注[9-10]。铁沉积水平与帕金森病患者认知功能缺损的严重程度相关,但其具体分子机制尚未阐明[11]。目前,有关铁沉积与多巴胺能神经元氧化应激、神经炎症之间关系的研究较多,而星形胶质细胞(astrocyte,AS)等神经胶质细胞在维持脑内铁稳态方面具有重要的作用[12]。故脑内细胞的体外共培养模型能模拟体内复杂的生理环境,可用于基础实验研究。许曼曼[12]采用Transwell小室共培养大鼠原代AS与腹侧神经元细胞发现,AS可加快铁离子在胞内的转入与转出,其机制可能是其通过蛋白激酶C途径激活6-羟基多巴胺,促进缺氧诱导因子α与膜铁转运蛋白1等结合,加快铁离子在胞内的转入与转出,从而加重神经元功能的减退。有学者将经过黑色素处理的神经胶质细胞与神经元细胞混合培养,结果显示神经胶质细胞具有减轻帕金森病黑色素神经毒性作用的潜力[13]。AS与神经元细胞共培养可通过核因子E2相关因子2系统诱导戊糖酸途径活化,保护神经元细胞免受多巴胺毒性的影响[14]。与单培养模型相比,共培养小胶质细胞可下调病原体反应途径,上调稳态功能途径,并促进抗炎和重塑细胞因子反应,表明共培养模型或许更适合模拟小胶质细胞的生理学特性[15]。有学者通过建立诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)产生的AS与小胶质细胞体外共培养模型,分析两种胶质细胞在β淀粉样蛋白(amyloid-beta protein,Aβ)和αSYN清除过程中的协调作用,结果发现与AS相比,小胶质细胞能更好地降解聚集的Aβ和αSYN,这两种细胞类型之间的相互作用涉及蛋白质聚集体从AS转移到小胶质细胞,该研究结果对于研究神经退行性疾病的新治疗靶点具有重要意义[16]。

2.1.2 细胞体外共培养模型在帕金森病治疗研究中的应用:Du等[17]使用Transwell小室插入物建立诱导iPSC衍生的神经元-AS共培养模型,结果发现AS可以减轻线粒体毒素损害,可能起到治疗帕金森病患者多巴胺能神经元中的线粒体功能障碍的作用。有学者通过建立神经元PC12细胞和N9小胶质细胞的间接共培养模型,研究白藜芦醇二聚体ε-长春花素对小胶质细胞活化的抑制作用,结果发现ε-长春花素可以抑制PC12细胞因氧化应激诱导的细胞凋亡,还可以抑制小胶质细胞向M1表型极化,防止神经细胞凋亡[18]。

2.2 细胞体外共培养模型在阿尔茨海默病中的应用 阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease AD)是一种无法治愈的神经退行性疾病,临床表现为进行性认知功能下降,发病初期患者的短期记忆功能受损最为明显,疾病发展至后期还会影响语言、情绪、运动与生理功能[19],主要发病机制包括淀粉样聚集、神经炎症等[20],病理特征主要为Aβ积累、磷酸化tau形成、神经胶质细胞过度活化和神经元丢失[21]。

2.2.1 细胞体外共培养模型在AD分子机制研究中的应用:在AD早期,神经元、神经胶质细胞参与的神经炎症会驱动疾病隐匿进展,最终导致其出现认知障碍,故细胞病理学是早期AD研究的重点[22]。利用细胞体外共培养模型探讨神经元与神经胶质细胞之间的相互作用,对揭开AD致病分子机制至关重要[23]。目前尚缺乏能够全面观察AD患者大脑中多阶段细胞间相互作用的体外细胞模型[24]。但AD神经3D共同培养系统模型可利用微流体装置高度真实模拟AD患者的大脑平台,反映神经元-小胶质细胞-AS炎症反应[25]。该模型将人类神经元、AS和小胶质细胞共培养以模拟AD环境,其中中央腔室装载神经元/AS分化细胞,而角室装载小胶质细胞,中央室和角室通过迁移通道连接,可观察小胶质细胞在单细胞分辨率下的实时迁移活动,如Aβ聚集、tau磷酸化、小胶质细胞募集、神经元-小胶质细胞相互作用的神经毒性作用,这为研究AD的神经炎症分子机制提供了有效的模型,并可能有助于寻找新的治疗靶点[21]。

外泌体是一种小细胞外囊泡,直径为20～120 nm[26],可以通过细胞通讯和分子运输,参与神经毒性[27]、神经退行性疾病[28]的发生、发展过程。研究表明,AD患者脑外泌体富含寡聚Aβ[29],将与红色荧光蛋白标记的外泌体共同孵育3 h的SH-SY5Y神经细胞置于Transwell小室下室,以及iPSC AF22供体细胞接种在孔径为0.4 μm的聚碳酸酯膜过滤器上共培养24 h,结果显示这些红色荧光蛋白标记的外泌体在与共培养的神经元一起孵育时被神经细胞通过胞吞作用消化,外泌体能将Aβ低聚物在神经元之间进行传播,从而引起细胞毒性,成为AD的新型细胞间信使[30-31]。研究显示,将AS单层单独培养3 d后,与神经元以体积比为2 ∶5的比例继续共培养7 d,然后将小胶质细胞与神经元以体积比为1 ∶5的比例接种于AS-神经元顶部,或可作为研究AD神经炎症的共培养模式[32]。AD反应性AS对神经元的非细胞自主毒性高度依赖AS和神经元的细胞比例,但混合比例的培养要求较高,难以精确调控细胞比例[33]。

2.2.2 细胞体外共培养模型在AD治疗研究中的应用:神经干细胞(neural stem cell,NSC)移植是AD的主要治疗方法,NSC的分化及营养因子的分泌受脑内微环境的影响,目前NSC与各种胶质细胞之间的分子机制尚未完全明确[34]。有学者将原代神经元细胞置于Transwell下室,在Transwell上室添加原代AS、小胶质细胞、NSC,并分别加入含fAβ25-35细胞培养基,结果显示,NSC可减少Aβ诱导的神经元凋亡[35]。将家族性AD突变的神经细胞与间充质干细胞衍生的外泌体共同培养,可以降低Aβ水平并上调记忆突触可塑性相关基因的表达[36],但大脑中间充质干细胞外泌体的数量有限,应寻找提高间充质干细胞外泌体大脑靶向能力的方法。

2.3 细胞体外共培养模型在缺血性脑卒中中的应用 缺血性脑卒中约占全部脑卒中的70%[37-38],主要临床表现为头晕、肢体乏力、语言及视觉功能异常等,病理特征为脑血管床内不可逆的损伤及形成梗死周围区域[39],主要病理机制包括神经炎症、血脑屏障损伤、内质网应激等[40],其中缺血后神经炎症的继发性进展是脑损伤的重要原因。

2.3.1 细胞体外共培养模型在缺血性脑卒中分子机制研究中的应用:缺血性脑卒中发病机制复杂,涉及神经胶质、神经元、血管细胞和基质成分之间的相互作用,这些细胞或成分统称为神经血管单元(neurovascular unit,NVU)[41]。由于缺血性脑卒中涉及的细胞单元复杂,目前尚缺乏灵敏性高且针对性强的诊断标志物[42],因此该病治疗手段有限[43]。NVU可以限制较大的极性物质和潜在的神经毒性分子被动扩散到患者大脑中[44],而大多数缺血性脑卒中患者存在NVU功能障碍。有学者将大鼠脑血管内皮细胞与周细胞单独培养或与AS混合培养,还有学者将上述细胞整合至Transwell小室共培养,以模拟缺血性脑卒中患者的血脑屏障,从而分析炎症刺激下血脑屏障与NVU的互相作用,但由于NVU功能极为复杂,单纯的2D培养存在局限性,或半透膜的存在缺乏流动性,使得细胞之间无法直接接触[45-47]。研究表明,微流体平台的NVU建模方式有利于分层培养3D细胞培养物(NVU芯片),通过改进生物技术,可以精确控制介质流量,以及调节培养微环境的参数[48-49],从而将原代脑血管内皮细胞与iPSC来源的AS和神经元共同培养在不同的通道上,并可在芯片底部自动进行培养基的抽吸、细胞混悬液的种植,建立体外缺血性脑卒中模型以供实验研究之用[50]。但此实验方法亦存在不足,一是应用荧光素钠检验NVU屏障特性可能会受到动物体内阴离子对转运蛋白的作用而出现结果偏倚;二是血脑屏障转运蛋白的RNA分子水平机制复杂,未来仍需对乳腺癌耐药蛋白1和葡萄糖转运蛋白1等蛋白进行功能评估;三是该实验系统操作难度较高,需要在相关专家指导下进行,推广应用受限。

2.3.2 细胞体外共培养模型在缺血性脑卒中治疗研究中的应用:小胶质细胞表型极化在缺血性脑卒中的神经炎症过程中起着重要的作用,可维持神经元和血脑屏障的功能[51]。有学者将BV2小胶质细胞与人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y共培养,同时将长春西汀干预后的BV2小胶质细胞单独缺氧缺糖培养后再与SH-SY5Y细胞在缺氧缺糖条件下共培养,结果表明,经长春西汀处理的BV2细胞可以减轻共培养系统中缺氧缺糖诱导的神经元损伤,其机制可能与长春西汀减少小胶质细胞中的磷酸二酯酶,抑制小胶质细胞M1表型,增强自噬通量,保护神经元的存活有关[52],初步验证长春西汀或可作为新的神经保护剂。有学者将经过缺氧缺糖刺激的神经元细胞系N2a细胞与条件培养基刺激的BV2小胶质细胞共培养12 h,构建神经元-小胶质细胞共培养模型,发现褪黑素通过信号转导和转录激活因子3途径,调节小胶质细胞向抗炎表型分化,从而对缺血性脑卒中小鼠的神经起到保护作用[53],但该方法使用的是非原代培养细胞,或许未能真实地体现缺血性脑卒中的细胞受损机制。NSC的低存活率及低分化率限制其在缺血性脑卒中的应用,神经胶质细胞的活化可能影响NSC的增殖和分化[54]。研究显示,将谷氨酸预处理的神经胶质混合细胞与NSC共培养,发现小胶质细胞和AS可诱导NSC的神经元分化并减少神经球的凋亡,将NSC与AS或小胶质细胞共同移植至缺血性脑卒中大鼠模型,可较好地改善大鼠的神经损伤[55],但此神经胶质细胞混合培养的方式增加了后续实验定量与定性分析单类细胞作用的难度。间充质干细胞具有诱导神经元修复作用,将其与缺氧缺糖处理过的M17神经元细胞间接共培养,可通过降低炎症因子表达水平,修复缺血性脑卒中大鼠模型的神经功能[56]。

2.4 细胞体外共培养模型在肌肉萎缩侧索硬化中的应用 肌肉萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ASL)是一种进展速度较快且可累及上下神经元的一类神经退行性疾病,临床表现为严重的肌肉萎缩,最终导致呼吸系统肌肉去神经支配而死亡。目前ASL的具体发病机制尚未阐明,但神经炎症已被证实是该病的重要发病机制之一[57]。

经典的核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)通路参与ASL的发病过程。有学者将运动神经元接种在涂有粘连蛋白的96孔板中,2 d后按每孔35 000个细胞的密度接种小胶质细胞并共培养72 h,结果显示,运动神经元存活率明显下降,NF-κB信号通路相关蛋白表达水平明显升高,且上述改变可被NF-κB抑制剂消除,说明小胶质细胞中NF-κB信号传导的缺失可减少运动神经元的死亡,这或可为ALS治疗提供新的治疗靶点[58],但该研究亦存在不足,即仅采用一种胶质细胞模拟复杂的神经炎症过程。Smethurst等[59]使用iPSC衍生的运动神经元与AS共培养来模拟散发性ALS的早期细胞类型特异性特征,将未处理的AS与种子聚集的运动神经元间接共培养7 d,发现TDP-43蛋白寡聚体对运动神经元具有毒性作用,但对AS无毒性作用,且AS可以通过减少TDP-43蛋白寡聚体的毒性来保护种子聚集的运动神经元。目前,有关细胞体外共培养模型在ASL治疗中的应用研究较少,这可能与该病的致病机制尚未明确有关。

3 小结与展望

神经胶质细胞与神经元细胞的体外共培养模型是研究神经系统疾病的重要模型,永生细胞系增加了神经系统疾病研究中细胞培养技术的可重复性[60],目前已成为药理学和毒理学研究的重要工具。细胞体外共培养模型是多种基础疾病研究常用的体外模型,可以较为直观地演示疾病发生与发展的病理过程,且有利于对细胞进行人为干预,减少动物模型体内变量的影响,直接观察细胞之间的相互交流,还可以作为高通量药物的刷选手段,避免动物伦理问题。但是细胞体外共培养模型的原代培养细胞存在潜在问题:一是细胞因失去体内环境而有可能缺乏特征,以及细胞本身的表型被活化[61];二是人类大脑是复杂且精细的器官,脑神经细胞的结构精细、功能活跃,细胞系的传代及干预可能使得细胞共培养的体外模型失去体内表型而降低其研究结果的可靠性。

近年来,iPSC及其衍生的各种原代人类细胞的批准和上市,特别是人工芯片的发展,让细胞体外共培养模型能更真实地模拟疾病发生与进展过程。然而,由于捐赠者不同的限制,体外基础实验的一致性受到了影响。但亦有研究显示,不同捐献者的iPSC并不会影响实验结果[62]。此外,由于重编程、细胞选择、体外培养过程漫长等问题,iPSC模型可能导致表观遗传发生变化。尽管细胞体外共培养模型具有局限性,但其可以在明确的实验条件下提供比单细胞培养模型更真实的三维视图和信息,故其亦可用于科学基础研究。