镶嵌蒙脱石盐酸倍他洛尔微球的离子交换载药释药条件的优化与机制初探

叶菁华，李慧慧，柯远程，秦宏涛，马颖芸，肖梦莎，冼毅盈，侯冬枝

（广东药科大学药学院/广东省局部精准递药制剂工程技术研究中心/广东省药物新剂型重点实验室，广东 广州 510006）

青光眼是我国常见眼部疾病，同时亦是我国三大后天致盲因素之一[1-2]，随着病情发展，其病理性的眼压增高压迫视觉神经对患者造成不可逆的视觉损伤[3-4]。为防止病情恶化，临床上患者需长期使用倍他洛尔等降眼压药物，以防止视觉神经的损伤。盐酸倍他洛尔（betaxolol hydrochloride, BH）为一种β受体阻滞剂，目前市场上常被制成滴眼液给药。但由于传统滴眼液生物利用度低，患者需通过1 日5 次反复给药以达到治疗药效，给药次数多，导致患者依从性差，制备缓释制剂可有效改善该情况。BH 作为亲水性小分子药物，制备缓释制剂更具挑战性。为保证其缓释性能，本课题组研制镶嵌载体的离子交换微球，并寻找适合的药物载体。

蒙脱石（montmorillonite，MMT）具有天然纳米片层结构，由于同构取代，片层晶格结构中的高价铝离子、硅离子被低价的金属离子取代，使蒙脱石的片层具有永久的负电性，堆叠的片层间隙通过吸附各种阳离子以补偿电荷的损失，具有良好的吸附性能，应而常作为吸附剂用于污水处理[5-8]。蒙脱石片层间吸附的金属阳离子可交换的特性，表明蒙脱石可能具有通过离子交换的方式吸附阳离子型亲水性药物BH 的潜力[9]。离子交换药物载体释药依赖离子交换作用，不受崩解或溶蚀过程影响，故可以恒定速率释药。

近年来，MMT 作为药物辅料的相关研究已有文献报道[10-13]，但对MMT的载药性能和释药性能影响因素的研究尚少。为优化MMT 对亲水性小分子药物BH 的载药条件，本文探讨影响BH-MMT 载药量的因素，并进一步考察MMT对BH 的载药性能与缓释性能。

1 仪器与试药

1.1 仪器

BSA124S-CW 万分之一电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；Basic 磁力搅拌器（德国IKA 公司）；JY 92-II 超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技有限公司）；PHS-3F pH 计（上海雷磁仪器有限公司）；THZ-82气浴恒温振荡器（上海宵汉实业发展有限公司）；激光粒度分析仪（英国马尔文仪器有限公司）；LGJ-10C 冷冻干燥机（北京四环科学仪器有限公司）；UV-1800PC 紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）。

1.2 试药

盐酸倍他洛尔（质量分数99.5%，武汉远成共创科技有限公司）；蒙脱石（浙江三鼎科技有限公司）；NaH2PO4、H2SO4、H3PO4（分析纯，天津致远化学试剂有限公司）；Na2HPO4、HCl（分析纯，天津大茂化学试剂厂）。

2 方法与结果

2.1 BH-MMT的制备

精密称取适量的MMT和BH 置于烧杯中，加入适量去离子水或磷酸盐缓冲液，磁力搅拌初步分散后，水浴超声30 min，再于50 ℃水浴条件下磁力搅拌2 h 载药，期间每间隔0.5 h 开启磁力搅拌5 min，使絮凝的蒙脱石分散开。载药结束后，将MMT 混悬液离心，弃去上清液，收集沉淀的BH-MMT，冻干后，研磨粉碎，过200目筛，即得粉末状BH-MMT。

按上述BH-MMT的制备方法，载药结束后取上清液，过0.22 μm 的微孔滤膜，使用紫外分光光度计测定载药平衡时游离的BH 浓度，根据以下公式计算载药平衡时MMT的载药量（DL）和包封率（EE）：

式中：Qe为吸附平衡时每克MMT 吸附药物的质量（mg/g）；M1为MMT 的投药量（g）；M2为BH 的投药量（mg）；Ce为载药平衡时上清液的游离药物浓度（mg/mL）：V为上清液的体积（mL）。

2.2 蒙脱石载药条件的筛选

2.2.1 分散方式对蒙脱石的影响 MMT 属于超细粉体，在加入水中时，由于具有较强的亲水性，固液界面的MMT 可吸附水分溶胀成为凝胶状态，从而阻止水分进一步润湿内部未润湿的MMT，因此其充分分散较为困难。本文使用机械的方法加速MMT 的分散过程，考察了磁力搅拌（400 r/min）、水浴超声、细胞粉碎超声法（477 W，间隔5 s，超声10 min）对MMT在水中分散后的粒径的影响。使用激光粒度仪测定以不同分散方式分散在水中后的粒径及电位，温度为（25±1）℃，结果见表1。可见，MMT 是带有负电荷的微粒，水合粒径在纳米范围；通过搅拌的方式使MMT 分散均匀需要约3 h 的磁力搅拌，分散均匀后，粒径为475.33 nm，PDI 为0.376；使用水浴超声可以加快MMT的分散速度，约30 min，分散后的粒径为441.93 nm，PDI为0.382；细胞粉碎超声仪超声10 min 即可使MMT 均匀分散在水中，粒径为284.50 nm，PDI 为0.414。考虑粒径与MMT 的结构完整性，最终采用以磁力搅拌初步分散后，水浴超声30 min促进MMT分散的方法。

表1 不同分散方法分散后的蒙脱石粒径与电位Table 1 Particle size and potential of montmorillonite dispersed by different dispersion methods(±s,n=3)

表1 不同分散方法分散后的蒙脱石粒径与电位Table 1 Particle size and potential of montmorillonite dispersed by different dispersion methods(±s,n=3)

分散方法搅拌分散超声分散细胞粉碎超声粒径/nm 475.33±64.85 441.93±7.11 284.50±17.83 PDI 0.376±0.082 0.382±0.027 0.414±0.066 U/mV-36.33±0.46-36.90±1.47-40.77±0.12

2.2.2 载药时间对蒙脱石载药量的影响 以蒙脱石与BH 的质量比为1∶3，BH 质量浓度为3 mg/mL、载药介质为去离子水，载药温度为室温，在超声分散30 min后，考察蒙脱石的载药平衡时间在5 min ～2 h范围内的载药量，结果见图1。可见，在搅拌5 min及超声分散30 min 后，几乎已经达到载药平衡，MMT 对BH 的吸附是在较短的时间完成的，包括分散时间在内，1 h基本可完成载药过程。为确保达到载药平衡，采用的载药时间为2 h。

图1 载药时间对蒙脱石载药量的影响Figure 1 Effect of loading time on drug loading of montmorillonite

2.2.3 介质pH 值对蒙脱石载药量的影响 通过以不同pH 值的磷酸盐缓冲液为载药介质，考察pH 值对MMT载药的影响。按照1 mg/mL MMT、3 mg/mL BH 的浓度，载药介质为0.2 mol/L的pH 值为2、4、6、8 的磷酸盐缓冲液，在50 ℃水浴条件下载药，测定不同pH 条件下载药量，结果见图2。可见，在pH=2.0时，蒙脱石的载药量较低，与pH值4.0、6.0、8.0时差异具有统计学意义（P＜0.05）；在pH＞2 时，pH 改变对蒙脱石载药量的影响较小。在pH=2.0 时蒙脱石载药量显著降低，可能是因为在酸性环境下蒙脱石结构被破坏[14]，或可能与低pH值时溶液中的高浓度氢离子与药物竞争性吸附有关[6]。

图2 pH值对载药量的影响Figure 2 Effect of pH value on drug loading

2.2.4 介质离子浓度对蒙脱石载药量的影响 通过控制溶液中磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）的浓度，考察离子浓度对蒙脱石载药量的影响。按照1 mg/mL MMT、3 mg/mL BH的浓度，载药介质为0.05、0.1、0.2、0.3 mol/L 的pH=4 的PBS，在50 ℃水浴条件下载药，测定不同磷酸盐浓度条件下的载药量，结果见图3。可见，总体上蒙脱石的载药量随着PBS 浓度的增加逐渐降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），所以溶液中加入PBS 不利于MMT对BH的吸附。

图3 介质离子浓度对载药量的影响Figure 3 Effect of ion concentration on drug loading

2.2.5 载药温度对蒙脱石载药量的影响 通过控制载药的水浴温度，考察温度对蒙脱石载药量的影响。按照1 mg/mL MMT、3 mg/mL BH的浓度，载药介质为去离子水，在0、25、50、70 ℃水浴条件下载药，测定不同载药温度条件下的载药量，见图4。可见，总体载药量均值的差异具有统计学意义（P＜0.05）；随着温度的升高，蒙脱石的载药量逐渐降低，所以较高的温度不利于MMT对BH的装载。

图4 载药温度对载药量的影响Figure 4 Effect of temperature on drug loading

对实验数据采用以下Gibbs 方程进行热力学分析，结果见表2：

表2 蒙脱石吸附BH的热力学参数Table 2 Thermodynamic parameters of BH adsorbed by montmorillonite

式中：Ke为热力学平衡常数；ρ为水的密度，单位mg/（cm3）；ΔG为吸附剂吸附的吉布斯自由能，单位kJ/mol；ΔH为吸附剂的吸附熵变，单位kJ/（mol·K）；ΔS为吸附熵变，单位kJ/（mol·K）；R 为理想气体常数，等于8.314 J/（mol·K）；T为热力学温度，单位K。

可见，ΔG＜0，说明MMT对BH吸附过程属于自发性反应；ΔH＜0，该过程属于放热反应，低温有助于蒙脱石载药反应正向进行；ΔS＞0，说明载药过程中固液界面的混乱程度增加。

2.3 蒙脱石载药的吸附机理

为继续优化BH-MMT的制备条件，进一步研究MMT 对BH 的吸附机理，分别按照以下Langmuir和Freundlich等温方程进行线性拟合：

式中：Qm为每克蒙脱石吸附药物的最大量，单位mg/g；a为与蒙脱石吸附性能有关的Langmuir 常数，单位L/mg；Kf和b 分别为与吸附容量和吸附强度有关的Freundlich常数。

精密配制40 mg/mL MMT，以其为母液分别配制0.5、1、1.5、2、3、5、7、9、15、18、21、24 mg/mL 的BH 溶液，进行水中载药的吸附实验，等温吸附拟合的结果见图5 和表3。由拟合计算结果可见，Langmuir 等温吸附模型对MMT 吸附BH 的拟合效果更好，R²为0.999 8，Freundlich 等温吸附模型的R²为0.973 9，拟合度劣于前者，证明MMT 对BH 的吸附符合Langmuir 吸附模型，表明BH 单层吸附于MMT，由Langmuir 吸附模型计算出最大吸附量Qm为441 mg/mL。

图5 Langmuir等温吸附模型（A）与Freundlich等温吸附模型（B）Figure 5 Fittings of Langmuir model（A）and Freundlich model（B）

表3 蒙脱石等温吸附拟合参数Table 3 Parameters of the isothermal adsorption models of montmorillonite

蒙脱石载药符合Langmuir 模型，该模型表明蒙脱石属于单层吸附，具有一个吸附限度，接近吸附的限度时，即使提高投药量，蒙脱石的载药量也不会显著提高。最终制备的蒙脱石载药量为（27.52±0.56）%，包封率为（54.26±1.51）%。

2.4 BH-MMT的缓释性能

考察相同条件下制备的BH-MMT的体外释放，评价MMT 作为缓释药物载体的缓释性能。释放介质选用人工泪液，配制方法如下：量取1 L 的去离子水，分别加入6.78 g NaCl、1.38 g KCl、2.18 g NaHCO3、0.084 g 二水氯化钙依次溶解，得到人工泪液。将处理好的透析袋剪成7 cm 的小段，在透析袋中加入50 mg BH-MMT，2 mL 去离子水，两端用尼龙绳扎紧，放入250 mL烧杯中，加入100 mL人工泪液，34 ℃、120 r/min 气浴恒温振荡，于0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、9、10 h，用5 mL移液管取5 mL 释放介质，并补充新鲜的释放介质5 mL。选用相当于BH-MMT 中药物含量的BH 水溶液为对照，考察透析袋的缓释效果。通过测定取出的释放介质中的药物含量Cn，根据以下公式计算BH 在不同时间点的释放度W，并绘制释放曲线：

式中：W为累积释放度；Cn为第n次取样时介质中的药物浓度，单位mg/mL；Va为释放介质体积，单位mL；Ci为第i次取样时介质中的药物浓度，单位mg/mL；Vi为第i次取样体积，单位mL。图6 为BH 溶液和BH-MMT 的体外释放曲线。可见，BH 溶液在3 h达到完全释放，释放度达97.87%；BH-MMT在8 h释放95.25%，药物均完全释放。根据2020 年《中国药典》规定，缓释制剂在前0.5 h 的释放量应小于40%，BH溶液在0.5 h释放度达46.98%，而BH-MMT的释放度为35.54%，符合缓释制剂的要求。MMT作为药物缓释载体，可达到良好的缓释效果。

图6 BH、BH-MMT的体外释放Figure 6 In vitro release of BH and BH-MMT

3 讨论

离子交换过程是药物分子竞争性置换离子交换材料上的同号离子，在水溶液中呈阳离子态的倍他洛尔与MMT 以离子键或复合物形式结合形成BH-MMT，完成载药过程；当BH-MMT 遇水或体液时，外界离子（如钠离子等阳离子）与BH-MMT上的药物离子发生竞争性取代，从而释放药物。

由于MMT 属于超细粉体，其在水中分散均匀较为困难，需要采用机械方式促进其均匀分散。本课题组发现超声可以有效促进MMT在水中分散，分散均匀后粒径为441.9 nm，使用细胞粉碎超声可以将MMT的片层进一步剥离为更小的颗粒284.5 nm。

纳米粒径有利于MMT 单独或与其他辅料结合后，作为纳米缓释药物载体用于制备粒径较小的纳米粒及缓释微球。超声细胞粉碎仪处理后，蒙脱石的粒径最小，但根据Chen 等[15-16]的研究报道，蒙脱石可通过物理过程自发分层，在细胞粉碎超声中MMT 片层被剥离，破碎为更小的粒子，剥离片层的不均匀使其具有较大的PDI。同时，细胞粉碎超声使蒙脱石微粒具有更低的电位，由于细胞粉碎超声使蒙脱石产生的新生片层亦呈现出负电性，使系统拥有了更高的负电位，对与同样荷负电的角膜黏蛋白具有静电斥力，不利于MMT在眼表的黏附滞留。

磁力搅拌的分散方式耗时较久，细胞粉碎超声又会使MMT 破碎，本课题组采用磁力搅拌初步分散后水浴超声的方式促进MMT的分散。

在观察MMT 在水溶液分散的过程中发现，由于MMT 颗粒表面带有强负电荷，彼此静电排斥，呈悬浮分散状态。在加入药物溶液后，阳离子药物BH 吸附在MMT 表面，降低微粒表面的负电荷及双电层厚度，使微粒之间的斥力减小，出现絮状聚集，该现象有利于蒙脱石载药后的离心收集。研究pH对MMT载药量影响的过程中发现，在pH=4、6、8时对载药量的影响较小，但当pH 值低至2 时，载药量显著降低。相较于MMT 分散在去离子水中形成较为稳定的混悬液，MMT 在BH 溶液或酸溶液中会发生絮凝沉淀。而通过控制溶液中PBS 的浓度，发现随着PBS 浓度的增加，蒙脱石的载药量逐渐降低，本文认为溶液中加入PBS 不利于MMT 对BH 的吸附。因为当载药体系中存在其他阳离子，可与阳离子药物BH 发生竞争性吸附，降低了BH 在MMT 上的载药量。低pH 值时载药量的下降，亦可能是因为溶液中的高浓度氢离子与药物竞争性吸附。因此实验采用去离子水作为离子交换载药介质。

本文通过研究不同条件对BH-MMT 的载药量的影响并探究MMT对BH 的吸附机理，据此优化载药条件后所制得的BH-MMT亚微米药物缓释载体，制备方法简单易行，所需载药时间短，相比其他纳米制剂的制备更便捷。BH-MMT 载药量较大（27.52±0.56）%，包封率较高（54.26±1.51）%，且可缓释8 h，说明离子交换载体MMT 对亲水性小分子模型药物BH 具有良好的缓释效果，有望解决青光眼患者因给药次数过多而依从性较差的情况。后续将使用BH-MMT 制备眼部黏附滞留的离子交换型微球制剂，进一步开展其治疗青光眼的毒理、药效和药动实验。