cAMP/PKA-pCREB 信号通路在早期康复训练改善脑卒中患者神经功能中的作用

孙小星 顾玉玲 陈文雅 周徐 周晓茂 孙龚卫

缺血性脑卒中是临床常见的脑卒中类型，以脑组织缺血缺氧损害为基本病理生理特征，虽然通过介入、抗凝、溶栓等治疗能够恢复缺血脑组织的血流、减轻缺血缺氧损害，但因为部分脑组织已经发生不可逆损害、所以会遗留不同程度的神经功能缺损，诸如认知功能障碍、运动功能障碍、语言功能障碍等［1-2］。随着近些年缺血性脑卒中综合治疗手段的不断发展，早期康复训练对缺血性脑卒中患者神经功能的改善作用受到越来越多关注［3-4］。相关的动物实验及分子生物学实验证实康复训练改善脑缺血大鼠神经功能的作用与激活环腺苷酸（cyclic adenosine mono-phosphat，cAMP）/蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）-磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（phosphorylated cAMP-response element binding protein，pCREB）信号通路 有关［5］。为深入认识早期康复训练改善缺血性脑卒中患者神经功能的分子生物学机制，本研究对cAMP/PKA-pCREB 信号通路在早期康复训练改善脑卒中患者神经功能中的作用展开分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019 年1 月到2022 年5 月期间江苏南通第三人民医院收治的缺血性脑卒中患者作为研究对象，纳入标准：①符合缺血性脑卒中的诊断［6］；②发病后48 h 内入院；③接受常规保守治疗，抗凝、调脂、改善循环等；④住院期间进行康复训练。排除标准：①生命体征不稳定、合并意识障碍或其他无法配合康复训练的原因；②有脑卒中、脑外伤、脑肿瘤、脊髓损伤等病史；③合并恶性肿瘤、自身免疫性疾病。共纳入84 例患者，根据住院期间康复训练的开始时间不同分为观察组（n=36）和对照组（n=48）。观察组中男性22 例、女性14 例，年龄（53.38±6.32）岁，起病时间（29.32±5.23）h；对照组中男性28 例、女性20 例，年龄（51.94±5.88）岁，起病时间（28.85±4.85）h。两组间一般资料的比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 干预方法

观察组患者进行早期康复训练，康复训练的开始时间为抗凝、调脂、改善循环等缺血性脑卒中常规治疗24 h 内且监测生命体征稳定、无生命危险。对照组进行常规康复训练，康复训练的开始时间为缺血性脑卒中常规治疗3～5 d 且病情稳定时。训练内容如下：①关节运动：在床上进行关节被动运动，运动顺序由大关节到小关节、由健侧到患侧，运动幅度由小到大，每天2 次、每次15 min；②翻身训练和按摩：每2 h 进行1 次翻身，翻身后摆放肢体在功能位；对患者上下肢进行有节奏的按摩；③系统功能训练：待患者神经功能逐步恢复后，先在床边进行肢体和躯干的运动功能训练，然后进行上下楼及步行训练、协调和平衡训练、日常生活动作训练等。本研究经江苏南通第三人民医院临床伦理委员会批准，取得患者知情同意。

1.3 观察指标

1.3.1 干预前后的神经功能评分

干预前后均参照指南［6］对两组的神经功能进行评价，所用工具包括简易智能精神状态检查量表（Mini mental state examination，MMSE）、蒙特利尔认知评估量表（Montreal cognitive assessment，MoCA）、Fugl-Meyer 运动功能量表（Fugl -Meyer assessment，FMA）、Berg 平衡量表（Berg balance scale，BBS）。

1.3.2 干预前后的血清标志物

干预前后均在生化采血管内采集空腹外周静脉血3～5 mL，静置凝血后按照半径10 cm、速度3 000 r/m 离心10 min，分离血清并采用酶联免疫吸附法试剂盒（上海西唐生物科技公司）进行检测，检测指标包括cAMP、PKA、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化力（TAOC）、B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3）。

1.3.3 干预前后的外周血pCREB 表达水平

干预前后均在血常规采血管内采集空腹外周静脉血3～5 mL，采用密度梯度离心法分离单个核细胞，加入细胞裂解液、提取细胞蛋白，采用Western blot 法检测外周血单个核细胞中pCREB的表达水平，pCREB 一抗为美国Abcam 公司、稀释比例为1∶800，以β-actin 为内参、计算pCREB 的表达水平。

1.4 统计学处理

采用SPSS 23.0 软件进行统计学处理。实验数据均符合正态分布、计量资料以（）描述，并进行独立样本t检验或配对样本t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组干预前后神经功能评分的比较

干预后，两组MMSE、MoCA、FMA、BBS 评分均高于组内干预前（P＜0.05），且观察组高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组干预前后认知功能及运动功能相关评分的比较（）Table 1 Comparison of cognitive function and motor function related scores between the two groups before and after intervention（）

表1 两组干预前后认知功能及运动功能相关评分的比较（）Table 1 Comparison of cognitive function and motor function related scores between the two groups before and after intervention（）

注：组内干预后与干预前比较，aP＜0.05。

2.2 两组治疗前后血清cAMP、PKA 及外周血pCREB 的比较

干预后，两组血清cAMP、PKA 含量及外周血pCREB 表达水平均高于组内干预前，且观察组高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2、图1。

图1 两组治疗前后外周血pCREB 的蛋白条带Figure 1 Protein bands of pCREB in peripheral blood of patients before and after treatment in both groups

表2 两组治疗前后血清cAMP、PKA 及外周血pCREB 的比较（）Table 2 Comparison of serum cAMP，PKA and peripheral blood pCREB before and after treatment between the two groups（）

表2 两组治疗前后血清cAMP、PKA 及外周血pCREB 的比较（）Table 2 Comparison of serum cAMP，PKA and peripheral blood pCREB before and after treatment between the two groups（）

注：组内干预后与干预前比较，aP＜0.05。

2.3 两组治疗前后血清炎症因子的比较

干预后，两组血清TNF-α、IL-1β、IL-6 含量均低于组内干预前，且观察组低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 两组治疗前后血清TNF-α、IL-1β、IL-6 的比较（）Table 3 Comparison of serum TNF-α，IL-1β and IL-6 before and after treatment between the two groups（）

表3 两组治疗前后血清TNF-α、IL-1β、IL-6 的比较（）Table 3 Comparison of serum TNF-α，IL-1β and IL-6 before and after treatment between the two groups（）

注：组内干预后与干预前比较，aP＜0.05。

2.4 两组治疗前后血清氧化应激指标的比较

干预后，两组血清MDA 含量均低于干预前且观察组低于对照组，SOD、TAOC 含量均高于干预前且观察组高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 两组治疗前后血清MDA、SOD、TAOC 的比较（）Table 4 Comparison of serum MDA，SOD and TAOC before and after treatment between the two groups（）

表4 两组治疗前后血清MDA、SOD、TAOC 的比较（）Table 4 Comparison of serum MDA，SOD and TAOC before and after treatment between the two groups（）

注：组内干预后与干预前比较，aP＜0.05。

2.5 两组治疗前后血清凋亡指标的比较

干预后，两组血清Bax、Caspase-3 含量均低于干预前且观察组低于对照组，Bcl-2 含量均高于干预前且观察组高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表5 两组治疗前后血清Bax、Bcl-2、Caspase-3 的比较（）Table 5 Comparison of serum Bax，Bcl-2 and Caspase-3 before and after treatment between the two groups（）

表5 两组治疗前后血清Bax、Bcl-2、Caspase-3 的比较（）Table 5 Comparison of serum Bax，Bcl-2 and Caspase-3 before and after treatment between the two groups（）

注：组内干预后与干预前比较，aP＜0.05。

3 讨论

缺血性脑卒中会引起神经功能损害，除了通过溶栓、介入、抗凝、改善循环等治疗手段改善缺血脑组织血流灌注以改善神经功能外，发病后及时进行康复训练也对改善神经功能具有重要意义［7-8］。

相关的临床研究认为康复训练的开始时间是影响缺血性脑卒中患者康复效果的重要因素，早期康复训练是神经功能改善的保护因素［9］。根据国内外学者的临床研究，早期康复训练的开始时机是缺血性脑卒中患者入院治疗24 h 内且病情稳定、无生命危险，早期进行康复训练的神经功能优于常规康复训练［10］。本研究收集了接受早期康复训练和常规康复训练的缺血性脑卒中患者，进行不同康复训练干预后从认知功能和运动功能两方面评价神经功能，与接受常规康复训练的患者比较，早期康复训练后的各项神经功能评分均明显增加，提示早期康复训练改善缺血性脑卒中患者的神经功能，与既往其他研究的结果一致。

缺血性脑卒中发病过程中神经功能的损害涉及复杂的分子生物学机制，缺血缺氧是导致神经功能损害的直接因素，与之相关的信号通路众多，所涉及的分子生物学因素包括炎症反应、氧化应激反应、细胞凋亡等［11］。一项动物实验的结果显示：康复训练促进脑缺血大鼠神经功能恢复的作用与激活cAMP/PKA-pCREB 信号通路有关。cAMP 是细胞内重要的第二信使，激活PKA后使下游CREB 磷酸化为pCREB；pCREB 具有转录调节活性，通过调节基因表达的方式在多种疾病模型中起到保护作用。在缺血性脑卒中、脑外伤、帕金森病等疾病中，cAMP、PKA、pCREB 均明显降低，激活cAMP/PKA-pCREB 通路起到神经保护作用［12］。本研究对该信号通路的检测结果显示：与接受常规康复训练的患者比较，早期康复训练后的血清cAMP、PKA 含量及外周血pCREB 表达水平均明显增加，提示缺血性脑卒中患者进行早期康复训练能够显著激活cAMP/PKA-pCREB通路。

cAMP/PKA-pCREB 信号通路的生物学作用多样，该通路在不同疾病模型中发挥保护作用与抑制炎症反应、氧化应激及细胞凋亡有关［13］。在缺血性脑卒中的治疗过程中，抑制炎症反应、氧化应激及细胞凋亡有利于神经元的存活和再生，进而促进神经功能恢复［14］。本研究对cAMP/PKA-pCREB 信号通路下游的炎症标志物、氧化应激标志物、细胞凋亡标志物展开分析，与接受常规康复训练的患者比较，早期康复训练后的血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、氧化应激产物MDA、促凋亡分子Bax、Caspase-3 的含量均降低，抗氧化物质SOD、TAOC 及抗凋亡分子Bcl-2 的含量均增加，提示缺血性脑卒中患者进行早期康复训练能够抑制炎症反应、氧化应激及细胞凋亡，这一作用与早期康复训练激活cAMP/PKA-pCREB 通路一致，同时以上作用可能是早期康复训练改善缺血性脑卒中患者神经功能的相关分子生物学机制。

综上所述，早期康复训练能够改善脑卒中患者的神经功能，这一改善作用与激活cAMP/PKApCREB 信号通路并抑制炎症反应、氧化应激、细胞凋亡有关。