血清miR-152、miR-153和miR-203 在宫颈上皮内病变中的表达及临床意义

胡引男 祝茹 吴秀秀 国萍

子宫颈癌（cervical cancer，CC）是全球女性最常见的癌症之一，高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是其主要发病原因［1］。根据组织学表型，子宫颈癌可分为浸润性鳞状细胞癌、腺癌和其他少见类型［2］。鳞状细胞癌主要起源于宫颈上皮内病变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN），CIN 是指宫颈上皮细胞的异常增生和变性，分为低度鳞状上皮内病变（Low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）和高度鳞状上皮内病变（High-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）［3-4］。宫颈上皮内病变是子宫颈癌的前期病变，如果不及时治疗，可能会发展成CC。因此，有必要发现新的生物标记物，以便及早发现高级别CIN。

微小RNA（microRNA，miRNA）是由约22 个核苷酸组成的小的内源性单链RNA，异常表达的miRNA 在肿瘤发生和发展中扮演着重要的角色［5］。miR-152、miR-153和miR-203在多种肿瘤中具有重要的调控功能［6-7］。本研究将通过分析宫颈上皮内病变患者miR-152、miR-153和miR-203表达情况，以期为临床宫颈上皮内病变的诊治提供新思路，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2019 年12 月至2020 年12 月安庆市立医院收治的宫颈上皮内病变患者80 例。根据宫颈上皮内病变级别［8］分为LSIL 组（n=48）和HSIL 组（n=32）。纳入标准：患者符合CIN 的诊断标准［9］；患者年龄在18～75 岁之间；患者在本院接受宫颈活检或宫颈锥形切除以获得宫颈组织样本，并采集其宫颈病变组织。排除标准：临床资料不全者；合并严重心、肝、肾相关疾病者；精神疾病或脑血管疾病患者；合并肿瘤患者。另选取同期因子宫肌瘤入院、宫颈筛查正常病例50 例作为对照组。本研究经本院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书并自愿参与研究。

1.2 资料收集及实验室检测

1.2.1 基本资料

收集患者性别、年龄、BMI、吸烟史等基本资料。

1.2.2 血清

CEA、CA199 和CA125 水平的测定采用ELISA（试剂盒购自上海信裕生物科技有限公司）测定血清CEA、CA199 和CA125 水平，使用酶标 仪在450 nm 处读取样品。

1.3 血清miR-152、miR-153和miR-203 水平检测

所有入组患者在入组72 h 内抽取静脉血5 mL，3 000 r/min（离心半径为10 cm）离心20 min 分离血清，使用TRIzol RNA 试剂盒（购自赛默飞世尔科技有限公司）提取总RNA，紫外分光光度计（上海美谱达公司）检测总RNA 浓度及纯度。取2 μg 总RNA 使用反转录试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司）进行反转录反应。取反转录产物进行PCR扩增。PCR 反应体系为10 μL体系，包括SYBR Premix Ex Taq 5 μL、正向引物0.3 μL、反向引物0.3 μL、cDNA 1 μL、双蒸水3.4 μL。用2^（-ΔΔCt）法计算各组基因的相对表达量。miR-152、miR-153和miR-203分子荧光PCR 引物序列见表1。

表1 miR-152、miR-153和miR-203 扩增引物序列Table 1 Amplified primer sequences for miR-152、miR-153 and miR-203

1.4 统计学分析

使用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析处理。符合正态分布的计量资料采用（）表示，采用独立样本t检验；计数资料以n（%）表示，采用χ2检验；将单因素分析中有统计学意义的纳入多因素分析，多因素分析采用Logistic 回归模型，诊断价值分析采用受试者工作特征曲线（ROC）进行评价，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床资料比较

两组年龄、BMI、吸烟史、CEA、CA199、CA125 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 两组临床资料比较［（），n（%）］Table 2 Comparison of clinical data between two groups［（），n（%）］

表2 两组临床资料比较［（），n（%）］Table 2 Comparison of clinical data between two groups［（），n（%）］

2.2 两组血清miR-152、miR-153和miR-203 水平比较

CIN 组血清miR-152、miR-153和miR-203水平显著低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 两组血清miR-152、miR-153和miR-203水平比较（）Table 3 Comparison of serum levels of miR-152，miR-153 and miR-203 between the two groups（）

表3 两组血清miR-152、miR-153和miR-203水平比较（）Table 3 Comparison of serum levels of miR-152，miR-153 and miR-203 between the two groups（）

2.3 多因素Logistic 回归分析CIN 的影响因素

将单因素分析中具有统计学意义的变量作为自变量，以是否CIN 作为因变量（是=1，否=0）进行多因素Logistic 回归分析，结果显示miR-152（OR=0.271）、miR-153（OR=0.201）和miR-203（OR=0.164）是CIN 的影响因素（P＜0.05）。见表4。

表4 多因素Logistic 回归分析CIN 的影响因素Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of the influencing factors of cervical intraepithelial lesions

2.4 miR-152、miR-153和miR-203 对CIN 的诊断价值

miR-152、miR-153和miR-203诊断CIN 的ROC曲线下面积分别为0.825、0.755 和0.792，miR-152、miR-153和miR-203的特异性/敏感性分别为80.55%/78.65%、72.12%/71.90%和76.93%/78.13%。见表5、图1。

图1 ROC 曲线Figure 1 ROC curve

表5 miR-152、miR-153和miR-203 对CIN 的诊断价值分析Table 5 Analysis of the diagnostic value of miR-152，miR-153 and miR-203 in cervical intraepithelial lesions

2.5 不同CIN 级别患者血清miR-152、miR-153和miR-203 水平比较

LSIL 组患者血清miR-152、miR-153和miR-203水平显著高于HSIL 组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表6。

表6 不同CIN 级别患者血清miR-152、miR-153和miR-203 水平比较（）Table 6 Changes of serum miR-152，miR-153 and miR-203 levels in patients with different CIN grades（）

表6 不同CIN 级别患者血清miR-152、miR-153和miR-203 水平比较（）Table 6 Changes of serum miR-152，miR-153 and miR-203 levels in patients with different CIN grades（）

3 讨论

子宫颈癌是全球女性第三大常见癌症，子宫颈癌的发展是一个多步骤的过程，通常经历正常宫颈上皮细胞（正常细胞）、子宫颈上皮细胞的早期变化、宫颈上皮内病变，最后发展为子宫颈癌。宫颈癌前病变通常是可以治愈的，在早期发现宫颈病变有助于改善临床结果，从而降低子宫颈癌患者的死亡率。通过寻找宫颈上皮内病变的诊断标志物，可以提高对该病变的早期检测和诊断的准确性和敏感性。

本研究发现，子宫颈癌患者miR-152、miR-153和miR-203的表达低于对照组，苏红娥等［10］研究发现，血清miR-153表达水平在子宫颈癌患者中明显下调，血清miR-153低表达与宫颈癌患者的临床分期、分化程度、浸润深度、淋巴结转移及脉管浸润有关。Wang等［11］研究发现，miR-152和miR-203在子宫颈癌患者中表达下调。以上研究结果均与本研究一致。进一步多因素Logistic回归分析结果显示，miR-152（OR=0.271）、miR-153（OR=0.201）和miR-203（OR=0.164）是宫颈上皮内病变的影响因素。提示miR-152、miR-153和miR-203的下调可能与宫颈上皮内病变的发展和进展相关，这些miRNA 的降低可能导致细胞增殖、分化和凋亡等异常的生物学过程，进而促进宫颈上皮细胞向恶性转化。这些结果进一步支持了miR-152、miR-153 和miR-203 在CIN 发展中的潜在作用，并强调了它们作为潜在生物标志物的重要性。

在本研究中，miR-152、miR-153和miR-203诊断CIN 的ROC 曲线下面积分别为0.825、0.755和0.792，miR-152、miR-153和miR-203的特异性/敏感性分别为80.55%/78.65%、72.12%/71.90%和76.93%/78.13%，这表明miR-152、miR-153和miR-203都具有较高的诊断学的价值。王媛媛等［12］研究发现，沉默lncRNA XIST、加入miR-153模拟物能明显降低宫颈癌细胞的侵袭、迁移及增殖，抑制增殖蛋白CDK4、Cyclin D1 及侵袭蛋白MMP-9、MMP-2的表达，降低EMT 相关基因SNAI1及相关蛋白N-cadherin、Vimentin、IL-6、SNAI1 的表达，促进E-cadherin 升高，说明沉默lncRNA XIST 靶向上调miR-153，可以抑制子宫颈癌细胞的迁移、侵袭以及上皮间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）。付建等［13］研究发现，宫颈癌组患者miR-152的表达水平低于癌前病变组，癌前病变组患者miR-152的表达水平低于宫颈炎组，miR-152在子宫颈癌诊断中具有较高的准确率，是宫颈癌和宫颈疾病早期诊断和筛查的主要标志物和重要手段。陈青青等［14］研究发现，miR-152在宫颈癌细胞株SiHa 中低表达，上调其表达可下调DNA 甲基化转移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）表达，抑制癌细胞的增殖，降低癌细胞的侵袭转移能力。李亚芹等［15］研究发现，过表达miR-203可降低SiHa 细胞的增殖率和迁移率，升高细胞凋亡率；相反，低表达miR-203可升高SiHa 细胞的增殖率和迁移率，降低细胞凋亡率，说明miR-203在子宫颈癌中可能具有调节细胞增殖、迁移和凋亡的重要功能，miR-203在子宫颈癌的诊断和治疗中可能具有潜在的应用价值。本文进一步研究发现，LSIL 组患者血清miR-152、miR-153和miR-203水平显著高于HSIL 组，说明miR-152、miR-153和miR-203可以作为LSIL 患者和HSIL 患者之间的区分指标。

综上所述，血清miR-152、miR-153和miR-203在宫颈上皮内病变患者中呈异常表达，三者或可作为诊断宫颈上皮内病变的指标。