三叶青叶不同萃取物的抗氧化和抗炎活性评价

刘伟民，熊科辉，刘洋，陈敏，吴思昊，许海顺，吴学谦1,

（1. 浙江农林大学，浙江 杭州 311300；2. 浙江省特色中药资源保护与创新利用重点实验室，浙江 杭州 311300；3. 浙江五养堂中药集团有限公司，浙江 遂昌 323300）

三叶青学名三叶崖爬藤Tetrastigmahemsleyanum，为葡萄科Vitaceae 崖爬藤属Tetrastigma多年生藤本植物[1]，主要生长在浙江、江西、福建、广西等省区的山林之中，是我国珍贵的林下中药材[2-3]。三叶青有清热解毒、化痰散结、消肿止痛等功效，常用于小儿高热惊厥、肺炎、肝炎等疾病的治疗[4]，现代也常用于恶性肿瘤的治疗。三叶青多以干燥块根入药[5]，而产量数倍于块根的叶片通常被废弃，造成极大的资源浪费。因此，加强对三叶青叶资源的综合开发利用，具有重要的经济效益和社会效益。目前，三叶青叶也开始广泛用于多种国药准字中成药和保健食品, 如结石康胶囊、排石利胆胶囊、三叶青茶等，但仍需进一步研究[6]。

鉴于此，本研究测定了三叶青叶片不同萃取物的总黄酮、总多酚含量，对各萃取物进行了抗氧化及抗炎比较实验，来评价三叶青叶片四个萃取物的抗氧化、抗炎活性，并联用HPLC 进一步分析相关性，筛选出开发潜力较大的萃取物，初步探究其物质基础，为进一步研究开发三叶青叶资源、提高三叶青资源利用率提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

试验用三叶青叶片于2022 年5 月采摘自浙江省遂昌县三叶青种植基地大棚种植的三年生三叶青，随机采摘成熟叶片，洗净沥干后经65 ℃干燥处理所得。

芦丁（批号100080-201811）、没食子酸（批号110831-201805）购自中国食品药品检定研究院；绿原酸（批号DST190906-021）、紫云英苷（批号DST190928-001）、咖啡酸（批号DST190517-013）、新绿原酸（批号DST190124-015）购自成都徳思特生物科技有限公司；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（Butylated hydroxytoluene, BHT）、青霉素、链霉素、二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide, DMSO）、脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）购自美国Sigma公司；1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）购自如吉生物科技有限公司；甲醇、乙腈购自美国TEDIA 天地试剂公司；RAW 264.7 细胞购自美国种质保藏中心；DMEM 培养基、胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS）购自美国Gibco公司；一氧化氮试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

设备和仪器包括Waters e2695 高效液相色谱系统（Waters 2998 PDA 检测器，美国沃特世仪器有限公司）、多功能酶标仪（BioTek Epoch 2，美国伯腾仪器有限公司）、电子分析天平（AL-104，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）等。

1.2 三叶青叶提取物的制备与萃取

称取干燥的三叶青叶100 g，用1 L 70%乙醇于室温25 ℃浸提6 h，共提取2 次，过滤合并滤液，减压浓缩至干，加入蒸馏水150 mL，混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇、水萃取，减压回收至干，依次命名为L-P，L-E，L-N，L-W。精密称取以上不同萃取物0.100 0 g，用甲醇定容至50 mL，配制成浓度为2.0 mg·mL-1的样品溶液。

1.3 总黄酮、总多酚的含量测定

取各样品溶液2 mL，根据文献[7]方法测定各萃取物中总黄酮的含量。取各样品溶液0.8 mL，根据文献[8]的方法测定各萃取物中总多酚的含量。

1.4 三叶青叶不同萃取物的抗氧化实验

1.4.1 DPPH 自由基清除率的测定 配制浓度0.04 mg·mL-1DPPH 溶液，4 ℃避光保存备用。按文献[9]方法进行实验，计算DPPH 自由基的清除率，实验重复3 次。纯净水为空白，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）为阳性对照。DPPH 自由基清除率计算公式如下：

式中，A0为不加样品，只加DPPH 溶液测定的吸光度；A1为不加DPPH，只加样品溶液测定的吸光度；A2为加试样反应后测定的DPPH 溶液吸光度。

1.4.2 还原力的测定 分别取各样品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0、1.4、1.8、2.0 mL，用甲醇补足至2 mL；按文献[10]方法进行实验测定吸光度，实验重复3 次。纯净水为空白，BHT 为阳性对照。

1.4.3 总抗氧化活性测定 分别取各样品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用甲醇补足至1 mL；按文献[11-12]方法测定吸光度，实验重复3 次。纯净水为空白，BHT 为阳性对照。

1.5 三叶青叶不同萃取物的抗炎实验

按文献[13]方法对购自美国种质保藏中心的RAW 264.7 细胞进行培养传代，用MTT 比色法检测细胞活性，通过LPS 建立炎症模型，将RAW 264.7 细胞用10 μg·mL-1各样品溶液处理，设置不添加LPS 及三叶青叶萃取物的空白对照组CK，孵育结束后取上清液，用NO 试剂盒测定NO 释放量。

1.6 三叶青叶乙酸乙酯、正丁醇萃取物HPLC 分析

标准品溶液的配制：精密称取芦丁、绿原酸、咖啡酸、紫云英苷、新绿原酸标准品各20 mg，加甲醇定容至10 mL，得到浓度为2.0 mg·mL-1的各标准品溶液。

吸取1.5 mL 各萃取物样品溶液，0.45 μm 滤膜过滤，进样体积10 μL。岛津C18 色谱柱（5020-39203），4.6 mm×250 mm，孔径5 μm，柱温30 ℃。色谱条件（A-乙腈，B-0.1%甲酸水含5%甲醇）：0 ～ 25 min，10% ～ 20%A；25 ～ 30 min，20% A；30 ～ 45 min，20% ～ 30% A；45 ～ 50 min，30% ～ 80% A；50 ～ 55 min，80% A。

1.7 数据分析

采用Excel 2021 和SPSS 26 软件处理与分析数据，求得各萃取物样品溶液的总黄酮、总多酚含量、DPPH 自由基清除率、还原力、抗氧化能力、NO 释放量，并进行显著性分析以及相关性分析，以P＜0.05 为显著差异水平。

2 结果与分析

2.1 三叶青叶不同萃取物总黄酮、总多酚含量测定

如图1、图2 所示，芦丁标准曲线的回归方程为y=7.681 5x+ 0.002 4，R2= 0.999 4。没食子酸标准曲线的回归方程为y= 41.384x+ 0.007 6，R2= 0.999 2。三叶青叶不同萃取物的总黄酮、总多酚含量见表1，单因素方差分析显示，不同萃取物的总黄酮含量F值为2 324.379，总多酚含量F值为390.220，差异性均为极显著（P＜0.01）。四种萃取物中总黄酮、总多酚含量的大小顺序一致，均为L-E＞L-N＞L-W＞L-P。

图1 芦丁标准曲线Fig. 1 Standard curve of rutin

图2 没食子酸标准曲线Fig. 2 Standard curve of gallic acid

表1 三叶青叶不同萃取物的总黄酮、总多酚含量Tab. 1 Total flavonoids and polyphenol content of different extracts from leaves of T. hemsleyanum

2.2 三叶青叶不同萃取物的抗氧化实验结果

2.2.1 DPPH 自由基清除率 采用DPPH 法测定了三叶青叶不同萃取物样品对DPPH 自由基的清除能力，结果如图3 所示。由图3 可知，三叶青叶乙醇提取物（醇提物）的不同萃取物均具有不同程度的DPPH 自由基清除能力。在SPSS 软件中导入图3 的浓度、DPPH 自由基清除率变量，通过Probit 分析计算半最大效应浓度值（EC50）。三叶青叶醇提物不同萃取物的EC50值分别为：L-P 0.5 mg·mL-1、L-E 0.08 mg·mL-1、L-N 0.05 mg·mL-1、L-W 0.3 mg·mL-1；BHT 的EC50值为0.002 mg·mL-1。以EC50值为评价标准，各萃取物的自由基清除能力为：BHT＞L-N＞L-E＞L-W＞L-P；以DPPH 自由基清除率为标准，各萃取物的自由基清除能力为：BHT＞L-E＞L-N＞L-W＞L-P。

图3 三叶青叶不同萃取物的DPPH 自由基清除率Fig. 3 DPPH radical clearance of different extracts from leaves of T. hemsleyanum

2.2.2 三叶青叶不同萃取物的还原力 一般情况下，物质的还原力越强，反映出物质的抗氧化活性也越强[14]。三叶青叶提取物不同萃取物的还原力如图4 所示。由图4 可知，三叶青叶提取物的不同萃取物均有一定的还原能力，且还原力与样品浓度呈正相关。在样品浓度相同的条件下，各萃取物还原力的排序为BHT＞L-E＞L-P＞L-W＞L-N。

2.2.3 三叶青叶不同萃取物的总抗氧化活性 三叶青叶各萃取物的总抗氧化活性如图5、图6 所示。由图5 可知，三叶青叶提取物不同萃取物的总抗氧化活性存在一定的量效关系。在实验设定的浓度条件范围内，总抗氧化能力为L-P≈L-E＞BHT＞L-N＞L-W。由图6 可看出，随着反应时间的延长，各萃取物的总抗氧化活性也在逐渐加强。

图5 三叶青叶不同萃取物的总抗氧化活性与浓度的关系Fig. 5 Relationship between total antioxidant activity and concentration of different extracts from leaves of T. hemsleyanum

图6 三叶青叶不同萃取物的总抗氧化活性与时间的关系Fig. 6 Relation of total antioxidant activity of different extracts from leaves of T. hemsleyanum with duration

2.3 三叶青叶不同萃取物的抗炎活性

NO 是炎症反应中发挥重要作用的促炎因子，其分泌量可间接反映炎症程度。本研究利用浓度为1 μg·mL-1的LPS 诱导RAW 264.7 巨噬细胞炎症模型，评估了三叶青叶不同萃取物的抗炎活性。图7 为MTT 法检测各萃取物对RAW264.7 细胞活力的影响。从图7 可以看出，各萃取物在2 ～ 20 μg·mL-1浓度时对巨噬细胞RAW 264.7 的生长无影响，说明药物在选定浓度范围内无细胞毒作用，所以选择10 μg·mL-1浓度作为处理浓度，考察三叶青叶不同萃取物对巨噬细胞RAW264.7 炎症模型的作用情况，结果见图8。从图8 表明，与LPS 组相比，三叶青叶不同萃取物的萃取液均降低了NO 的释放量，模型组的NO 释放量为28.35 μmol，L-P 为15.02 μmol，降低了47.24%，L-E 为18.87 μmol，降低了33.59%，L-N 为17.57 μmol，降低了38.19%，L-W 为19.00 μmol，降低了33.13%。NO 释放量排序为L-W＞L-N＞L-E＞L-P。三叶青叶不同萃取物中，L-P 的抗炎活性最佳，其次为L-E，然后是L-N，L-W 效果最差。

图7 不同质量浓度三叶青叶萃取物对细胞RAW264.7存活率的影响Fig. 7 Survival rate of RAW264.7 treated by different extracts from leaves of T. hemsleyanum with different concentrations

图8 三叶青叶不同萃取物提取液的抗炎活性Fig. 8 Anti-inflammatory activity of different extracts from leaves of T. hemsleyanum

2.4 三叶青叶提取物总黄酮、总多酚含量与抗氧化、抗炎能力的相关性

为评价三叶青不同萃取物总黄酮、总多酚含量与其抗氧化、抗炎活性的相关性，试验对不同萃取物的抗氧化、抗炎活性进行单因素方差分析，并利用Pearson 法进行了相关性分析，结果见表2、表3、表4。

表2 不同萃取物抗氧化、抗炎活性的方差分析Tab. 2 ANOVA on antioxidant and anti-inflammatory activity of different extracts

表3 总黄酮、总多酚含量与抗氧化、抗炎活性的相关性分析Tab. 3 Correlation analysis on total flavonoids and total polyphenols content with antioxidant and anti-inflammatory activities

表4 总抗氧化能力与NO 释放量的相关性分析Tab. 4 Correlation analysis on total oxidation capacity and NO-release

由表2 可见，萃取物的不同对DPPH 自由基清除率、还原力、总抗氧化活性、NO 释放量有极显著影响（P＜0.01）。表3 双变量相关性分析显示，总黄酮、总多酚含量与DPPH 自由基清除率、还原力极强正相关，相关性极显著（P＜0.01）；与总抗氧化活性、NO 释放量弱相关，相关性均不显著（P＞0.05）。由表4 双变量相关性分析显示，总抗氧化活性与NO 释放量负相关，相关性极显著（P＜0.01）。综上分析，总黄酮、总多酚含量与三叶青叶不同萃取物的抗氧化活性存在一定关联，与抗炎活性关联性不强，总抗氧化活性与NO 释放量负相关，可能受同一类活性物质的影响。

2.5 三叶青叶中黄酮和多酚类成分的同时测定

从相关性分析结果可以看出，三叶青叶中所含的总黄酮、总多酚含量对三叶青叶不同萃取物的抗氧化能力影响显著。选择总黄酮、总多酚含量较高的乙酸乙酯、正丁醇萃取物，利用HPLC 测定其中的芦丁、咖啡酸、荭草苷、新绿原酸、绿原酸含量，结果见图9 和表5。由图9 可见，三叶青叶乙酸乙酯萃取物与正丁醇萃取物均含有芦丁、荭草苷、咖啡酸、新绿原酸和绿原酸，但部分成分含量存在较大差异。由表5 可知，芦丁、咖啡酸、绿原酸的含量差异极显著（P＜0.01）。结合已知成分绝对含量与数据分析结果，推测芦丁、咖啡酸、绿原酸可能是三叶青叶不同萃取物抗氧化作用存在差异的成分群之一。

图9 三叶青叶乙酸乙酯、正丁醇萃取物的HPLC 分析Fig. 9 HPLC analysis on extracts from leaves of T. hemsleyanum by ethyl acetate and n-butanol

表5 三叶青叶乙酸乙酯、正丁醇萃取物的成分含量Tab. 5 Composition and content of extracts from leaves of T. hemsleyanum by ethyl acetate and water saturated n-butanol

3 讨论与结论

3.1 讨论

三叶青是我国特有的林下珍稀药用植物，生长于我国广大南方地区的高山幽谷之间，具有抗肿瘤、消炎、免疫调节等功效，其块根在民间被广泛使用。三叶青叶（或全株）在民间也供药用，福建、浙江地区传统习用三叶青鲜草，习称“一粒珠”[15]。《海南植物志》中记载三叶青全株可用于白喉、风湿性腰痛等，《台湾药用植物图鉴》中记载其鲜叶捣碎可以治皮肤病，且三叶青叶不仅采收加工方便、价格优惠，而且产量相较于地下块根更高，因此，开展三叶青叶的综合利用开发研究具有重要意义。

自由基能够降低细胞内的抗氧化酶活性[16]，造成活性氧的浓度增加，促进肿瘤的发生，而慢性炎症在癌症的发展中同样起促进作用，因此自由基、炎症及肿瘤三者之间存在一定关联性。何文等[17]对三叶青块根的不同萃取物进行了体外抗氧化研究，发现乙酸乙酯萃取物的抗氧化能力最强，且与总黄酮、总多酚含量显著相关。故本文采用DPPH、还原力、总抗氧化活性试验评价了三叶青叶不同萃取物的体外抗氧化活性，并采用LPS 诱导的细胞炎症模型评价了不同萃取物的抗炎活性，发现其抗氧化能力与总黄酮、总多酚含量显著相关，而抗炎能力与总黄酮、总多酚含量无明显相关性，可以初步推断影响三叶青叶抗氧化能力、抗炎能力的物质基础并不相同。后续可以从三叶青叶乙酸乙酯萃取物含量高的单体化合物中进一步筛选强抗氧化活性的物质，而具备抗炎活性的单体化合物还有待进一步探究。

3.2 结论

以上研究结果表明，三叶青叶的四种萃取物均含有黄酮类和酚类化合物，且均具有一定的抗氧化、抗炎活性，其中，乙酸乙酯萃取物的抗氧化活性最强，石油醚萃取物的抗炎活性最强，这与李红锐等[18]对蒙自蹄盖蕨Athyriummengtzeense醇提物的不同萃取物的体外抗氧化、抗炎活性评价结果相符。相关性分析证明，三叶青叶四种萃取物的清除自由基能力、还原力与总黄酮、总多酚含量显著相关，说明酚类和黄酮类物质可能是其抗氧化作用的物质基础。总抗氧化能力与NO 释放量显著相关，说明可能受三叶青叶中同一类活性物质的影响。HPLC分析结果表明，芦丁、咖啡酸、绿原酸可能是三叶青叶不同萃取物抗氧化作用存在差异的成分群之一。后续可考虑从三叶青叶乙酸乙酯和石油醚萃取物分离纯化出有关单体化合物，进而筛选出其具体的抗氧化、抗炎活性成分，为三叶青叶的进一步开发利用提供一定的理论基础。