新加苁蓉菟丝子汤通过调控AMPK/SIRT1 信号通路对卵巢储备功能减退大鼠线粒体功能的影响

史 薇，银雪梅，王智超，吴也可，吴克明*

（1.成都中医药大学附属医院，四川 成都 610000； 2.山西大学中医药现代研究中心，山西 太原 030000）

卵巢储备功能减退 （diminished ovarian reserve，DOR） 是指育龄期女性卵母细胞质量和（或） 数量过早减退的病理状态［1-2］。临床根据生育力减退、抗苗勒管激素（anti-mullerian hormone，AMH） 下降、基础血清促卵泡生成素 （follicle stimulating hormone，FSH） 升高等临床症状和指标异常予经验性诊断和治疗［3］。辅助生殖技术等疗法在提高临床妊娠率和降低流产率方面仍存在难点及不良反应诸多等问题，DOR 对生殖健康的不良影响已成为亟待解决的医学和社会问题。

肾精是生殖的基础，精血同源。吴克明教授认为DOR 根本病机是肾中精血亏虚，因虚致瘀，以补肾养血活血为治法创制的新加苁蓉菟丝子汤可有效提高生育能力，延缓卵巢功能减退进程［4-5］。课题组前期研究证实，新加苁蓉菟丝子汤及其药物单体可抑制卵巢颗粒细胞凋亡和自噬，对抗氧化应激，促进卵泡发育［6-8］。Kasapo ̆ɡlu 等［9］研究发现，卵泡储备和卵子质量与线粒体功能障碍相关； 能量稳态靶点腺苷活化蛋白激酶 （adenosine-activated protein kinase，AMPK） 和线粒体损伤应答关键沉默信息调节因子1 （silent mating type information regulator 1，SIRT1） 介导的信号通路可增加卵泡储备和卵巢寿命［10-11］。因此，本研究建立雷公藤甲素诱导的DOR 大鼠模型，给予新加苁蓉菟丝子汤和调经促孕丸进行干预，探究其对DOR 大鼠线粒体功能和AMPK/SIRT1 通路的影响，以期为中医药研究和临床治疗提供新的靶点和实验依据。

1 材料

1.1 动物 动情周期正常的3 月龄健康成年雌性SD 大鼠24 只，体质量200 ～250 g，由成都达硕实验动物有限公司提供 ［实验动物生产许可证号SCXK （川） 2020-030］，分笼饲养于四川生物医药产业技术研究院，温度24～26 ℃，相对湿度50% ～70%，昼夜光照，适应性喂养5 d，测试大鼠反应灵敏后用于实验。实验经成都中医药大学实验动物伦理委员会审批通过。

1.2 药物 新加苁蓉菟丝子汤由菟丝子15 g、肉苁蓉15 g、黄精10 g、淫羊藿15 g、覆盆子10 g、山茱萸10 g、熟地黄10 g、当归10 g、泽兰10 g、乌药10 g、山药10 g、枸杞子10 g 组成，经成都中医药大学附属医院华润三九药房以单味中药颗粒混合制成全方免煎颗粒（每135 g 生药加工成24.35 g免煎颗粒），根据《药理实验方法学》 等效剂量系数折算结合课题组前期实验，选择最佳剂量为5.11 g/kg［12］。调经促孕丸（水蜜丸5 g/袋，国药准字Z11020027） 购自北京同仁堂国药有限公司，研磨后用双蒸水配制成混悬液，成人临床用量为每天10 g，根据《药理实验方法学》 等效剂量系数折算成大鼠给药剂量为1.05 g/kg。雷公藤甲素（粉剂1 000 mg/支，批号DST210929-034） 购自成都德思特生物技术有限公司。

1.3 试剂 FSH、AMH、抑制素B （inhibin B，INHB） 酶联免疫吸附剂测定 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 试剂盒、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP） 试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号E-EL-R0391c、E-EL-R3022、E-EL-R1027c、E-BC-K157-M）； 电镜固定液 （武汉谷歌生物科技有限公司，货号G1102）； 活性氧（reactive oxygen，ROS）、线粒体膜电位 （mitochondrial membrane potential，MMP）检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号S0033S、C2006）； BCA 蛋白浓度测定试剂盒（合肥白鲨生物科技有限公司，货号BL521A）； 兔β-actin 抗体、兔AMPK 抗体、兔SIRT1 抗体、兔过氧化物酶体增殖物激活受体γ 辅助活化因子1（peroxlsomeproliferator-activated receptor-γ coactlvator-1α，PGC-1α） 抗体 （美国Affinity 公司，货号AF7018、AF6423、DF6033、DF7081）。

1.4 仪器 正置白光拍照显微镜（日本尼康公司）； 光谱仪（美国伯腾公司）； 透射电子显微镜（日本日立公司）； 流式细胞仪（德国贝克曼库尔特公司）； 电泳仪、垂直电泳槽及组件（美国伯乐公司）； 化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）； 台式高速冷冻型微型离心机（美国赛洛捷克公司）。

2 方法

2.1 模型建立 筛选动情周期正常的24 只大鼠，随机分为空白组、模型组、调经促孕丸组、新加苁蓉菟丝子汤组，每组6 只。除空白组外其余各组大鼠灌胃给予500 μg/kg 雷公藤甲素，连续30 d［12］。从造模第26 天起，每天上午9 点进行阴道脱落细胞涂片，连续5 d，观察动情周期变化，当大鼠均出现动情周期紊乱时可认为造模成功。

2.2 分组及给药 空白组、模型组大鼠灌胃给予生理盐水（1 mL/100 g），调经促孕丸组大鼠灌胃给予1.05 g/kg 调经促孕丸悬浊液，新加苁蓉菟丝子汤组大鼠灌胃给予新加苁蓉菟丝子汤5.11 g/kg每天1 次，连续2 周。

2.3 取材 各组大鼠末次给药1 h 后麻醉，腹主动脉采血，分离得到血清，于-20 ℃保存备用。无菌分离双侧卵巢，并分别用电镜固定液、4%多聚甲醛固定卵巢组织。

2.4 指标检测

2.4.1 一般情况、动情周期 每天定时观察大鼠饮水摄食、精神状态、皮毛光泽、行为反应。在造模第26～30 天、给药后第10 ～14 天进行阴道脱落上皮涂片，观察动情周期。

2.4.2 苏木素-伊红（HE） 染色观察卵泡发育情况 4%多聚甲醛固定的大鼠卵巢组织经脱水、包埋、切片、染色、封片，于显微镜下放大100 倍观察卵泡发育情况，规范各级卵泡、黄体判定图例；放大20 倍拍摄并计算初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡、闭锁卵泡、黄体数量。

2.4.3 ELISA 法检测血清FSH、AMH、INHB水平 大鼠全血2 000 r/min 离心10 min，取上清，按照ELISA 检测试剂盒说明书检测FSH、AMH、INHB 水平。

2.4.4 透射电镜观察卵巢组织线粒体结构 电镜液固定的大鼠卵巢组织经脱水、渗透、包埋、切片、染色，在透射电子显微镜下放大7 000 倍观察并采集图像。

2.4.5 流式细胞术检测卵巢组织ROS、MMP水平 取适量大鼠卵巢组织，加入含酶缓冲液，过滤后获取细胞悬液，离心弃上清，PBS 洗涤细胞，加入流式上样缓冲液重悬细胞并调整细胞密度，一部分细胞加入DCFH-DA 探针，于流式细胞仪上分析，以DCF 相对荧光量表示ROS 水平； 另一部分细胞加入JC-1 染色缓冲液，于流式细胞仪上分析检测，以JC-1 形成聚合物和单体的比值表示MMP水平。

2.4.6 分光光度法检测卵巢组织ATP 水平 使用裂解液充分匀浆裂解大鼠卵巢组织，按照ATP 试剂盒说明书加入工作液，采用分光光度法检测ATP 水平。

2.4.7 Western blot 法检测卵巢组织AMPK、SIRT1、PGC-1α 蛋白表达 采用RIPA 裂解提取大鼠卵巢组织总蛋白，蛋白定量试剂盒测定浓度，经电泳、转膜、封闭、孵育一抗、孵育二抗、显影，在化学发光成像系统下采集图像，以β-actin 为内参，通过Image J 软件测定灰度值。

2.5 统计学分析 通过SPSS 22.0 软件进行处理，符合正态分布的数据以（±s） 表示，组间比较采用单因素方差分析，事后多重比较采用Tukey 检验； 若数据不符合正态分布，采用非参数Kruskal-Wallis 检验，事后两两比较采用Mann-Whitney 法。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 新加苁蓉菟丝子汤对大鼠一般情况的影响 造模前大鼠反应灵敏，造模后大鼠逐渐出现反应迟钝、少量体毛脱落、喜蜷缩扎堆等表现，饮食和摄水量无明显变化，体质量降低（P＜0.01）； 新加苁蓉菟丝子汤干预后，大鼠脱毛现象好转，反应、活动敏捷度提升，体质量增加，见图1。

图1 各组大鼠体质量Fig.1 Rat body weight of each group

3.2 新加苁蓉菟丝子汤对大鼠动情周期的影响 大鼠动情周期约4～5 d，分为动情前期（有核上皮细胞为主）、动情期（角化上皮细胞为主）、动情后期（有核、角化上皮细胞和白细胞均可见）、动情间期（白细胞为主），若周期延长（≥6 d）、停滞（≥3 d） 或无周期（无序） 则判定为动情周期紊乱。造模的18 只大鼠均出现动情周期紊乱（延长44.44%，停滞16.67%，无周期38.89%），说明大鼠卵巢功能抑制，动情周期紊乱。调经促孕丸、新加苁蓉菟丝子汤干预后，部分大鼠恢复动情周期（周期正常50%，延长25%，停滞8.33%，无周期16.67%），其中新加苁蓉菟丝子汤干预后有4 只大鼠恢复动情周期，有效率为66.67%。动情周期判定标准见图2。

图2 大鼠动情周期（×100）Fig.2 Estrous cycle of rats （×100）

3.3 新加苁蓉菟丝子汤对大鼠卵巢各级卵泡及黄体数量的影响 与空白组比较，模型组初级卵泡、成熟卵泡数无明显变化（P＞0.05），次级卵泡、黄体数减少（P＜0.05，P＜0.01），闭锁卵泡数增加（P＜0.01）； 与模型组比较，调经促孕丸组、新加苁蓉菟丝子汤组初级卵泡、次级卵泡、黄体数增加（P＜0.05，P＜0.01），其中新加苁蓉菟丝子汤组闭锁卵泡数减少（P＜0.01）。各级卵泡、黄体典型图见图3，卵巢HE 染色见图4，卵泡、黄体计数见表1。

表1 新加苁蓉菟丝子汤对大鼠卵巢各级卵泡及黄体数的影响（±s，n＝6）Tab.1 Effects of Modified Congrong Tusizi Decoction on follicles at various levels and corpus luteum of rats （±s，n＝6）

表1 新加苁蓉菟丝子汤对大鼠卵巢各级卵泡及黄体数的影响（±s，n＝6）Tab.1 Effects of Modified Congrong Tusizi Decoction on follicles at various levels and corpus luteum of rats （±s，n＝6）

注： 与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01； 与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别初级卵泡/个次级卵泡/个成熟卵泡/个闭锁卵泡/个黄体/个空白组1.67±1.214.17±1.721.33±1.510.17±0.415.17±2.14模型组0.67±0.520.33±0.82**0.17±0.414.00±2.00**2.83±0.98*调经促孕丸组3.00±1.67＃5.67±4.27＃＃0.50±0.842.67±2.075.83±2.23＃＃新加苁蓉菟丝子汤组3.33±2.16＃＃7.67±4.50＃＃1.33±1.2210.17±0.41＃＃9.00±5.06＃

图3 各级卵泡、黄体（×100）Fig.3 Follicles and corpus luteum at all levels

图4 各组大鼠卵巢组织HE 染色（×20）Fig.4 HE staining for rat ovarian tissue of each group

3.4 新加苁蓉菟丝子汤对大鼠血清FSH、AMH、INHB 水平的影响 与空白组比较，模型组大鼠血清FSH 水平升高（P＜0.01），AMH 水平降低（P＜0.05），INHB 水平无明显变化（P＞0.05）； 与模型组比较，调经促孕丸组、新加苁蓉菟丝子汤组大鼠血清FSH 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），INHB水平无明显变化（P＞0.05），其中新加苁蓉菟丝子汤组大鼠血清AMH 升高（P＜0.05），见表2。

表2 新加苁蓉菟丝子汤对大鼠血清FSH、AMH、INHB 水平的影响（±s，n＝6）Tab.2 Effects of Modified Congrong Tusizi Decoction on serum FSH，AMH and INHB levels of rats （±s，n＝6）

表2 新加苁蓉菟丝子汤对大鼠血清FSH、AMH、INHB 水平的影响（±s，n＝6）Tab.2 Effects of Modified Congrong Tusizi Decoction on serum FSH，AMH and INHB levels of rats （±s，n＝6）

注： 与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01； 与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别FSH/（ng·mg-1）AMH/（pg·mg-1）INHB/（pg·mL-1）空白组21.20±5.18743.73±123.7130.86±7.80模型组37.46±8.71**534.76±38.85*24.92±6.42调经促孕丸组20.25±3.45＃＃815.34±277.2729.70±11.57新加苁蓉菟丝子汤组23.70±11.22＃745.03±166.16＃29.49±11.02

3.5 新加苁蓉菟丝子汤对大鼠卵巢组织线粒体结构的影响 空白组大多为正常线粒体，大小均匀，形态正常，膜结构完整，嵴清晰可见； 模型组多为严重损伤线粒体，其形态崩解、明显肿胀，部分膜结构模糊、嵴断裂甚至空泡化； 调经促孕丸组、新加苁蓉菟丝子组既有正常线粒体，也有损伤线粒体，部分形态损伤，轻度肿胀，膜结构基本完整，内部嵴结构模糊，见图5。

图5 新加苁蓉菟丝子汤对大鼠卵巢线粒体结构的影响（×7 000）Fig.5 Effects of Modified Congrong Tusizi Decoction on the structure of ovary mitochondria in rats （×7 000）

3.6 新加苁蓉菟丝子汤对大鼠卵巢线粒体功能的影响 与空白组比较，模型组大鼠卵巢组织ROS 水平升高（P＜0.01），ATP、MMP 水平降低（P＜0.01）；与模型组比较，调经促孕丸组、新加苁蓉菟丝子汤组大鼠卵巢组织ROS 水平降低（P＜0.01），ATP、MMP 水平升高（P＜0.01），见表3。

表3 新加苁蓉菟丝子汤对大鼠卵巢线粒体功能的影响（±s，n＝6）Tab.3 Effects of Modified Congrong Tusizi Decoction on the function of ovarian mitochondrial in rats （±s，n＝6）

表3 新加苁蓉菟丝子汤对大鼠卵巢线粒体功能的影响（±s，n＝6）Tab.3 Effects of Modified Congrong Tusizi Decoction on the function of ovarian mitochondrial in rats （±s，n＝6）

注： 与空白组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃＃P＜0.01。

组别ROSATP/（μmol·L-1）MMP空白组26 754.45±7 434.3616.35±1.0827.24±6.32模型组155 401.62±17 582.89**6.88±1.03**2.38±0.13**调经促孕丸组45 711.55±3 116.16＃＃9.52±1.44＃＃7.15±0.40＃＃新加苁蓉菟丝子汤组72 322.13±1 000.79＃＃11.61±0.20＃＃6.17±4.25＃＃

3.7 新加苁蓉菟丝子汤对大鼠卵巢组织AMPK、SIRT1、PGC-1α 蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组大鼠卵巢组织AMPK、SIRT1、PGC-1α 蛋白表达降低（P＜0.01）； 与模型组比较，调经促孕丸组、新加苁蓉菟丝子汤组大鼠卵巢组织AMPK、SIRT1、PGC-1α 蛋白表达升高 （P＜0.05，P＜0.01），见图6。

图6 新加苁蓉菟丝子汤对大鼠卵巢组织AMPK、SIRT1、PGC-1α 蛋白表达的影响（±s，n＝6）Fig.6 Effects of Modified Congrong Tusizi Decoction on the ovarian protein expressions of AMPK，SIRT1 and PGC-1α of rats （±s，n＝6）

4 讨论

肾为天癸之源，肾中精气充盛则卵子发育成熟排出以受孕。妇人以血为本，肾精所化阴血是月经来潮和孕育胎儿的前提。调经促孕丸中菟丝子、淫羊藿、丹参和鸡血藤共用，温肾且养血活血，具备临床疗效循证依据［13-16］。新加苁菟丝子汤中菟丝子和肉苁蓉补肾益精共为君药； 黄精、山茱萸、熟地黄、枸杞子、淫羊藿和覆盆子补肾之阴阳，当归和山药健脾养血，为臣药； 泽兰活血化瘀为佐药；乌药理气行滞为使药，诸药合用补肾益精、养血活血，治疗包括卵巢储备功能下降在内的卵巢功能减退类疾病。

卵巢是女性的生育调控中心，卵泡成熟与否决定女性生育力。颗粒细胞是卵泡发育的基础，线粒体是细胞能量供应的关键细胞器，对维持卵泡发育和产生高质量卵子具有重要作用［17］。线粒体呼吸链是细胞内ROS 产生的重要位点，因氧化损伤造成线粒体功能障碍是DOR 的重要发病机制［18-19］。氧化应激时，线粒体氧化磷酸化加快引起ROS 累积，造成线粒体肿胀、嵴断裂等结构损伤以及ATP合成障碍、线粒体膜电位失衡等功能损伤，颗粒细胞能量代谢异常而干扰卵泡发育进程［20-21］。AMPK是线粒体因子SIRT1 和PGC-1α 的上游控制靶点［22］。研究发现AMPK 在卵母细胞、颗粒细胞等中均有表达，参与卵泡发育的正负反馈调节，其失活会加速线粒体自噬并启动细胞程序性死亡［23-25］。Zhou 等［26］研究发现激活SIRT1 可抑制卵泡募集、发育与闭锁，减缓始基卵泡消耗速率，保护卵巢储备功能。在神经［27-28］、骨骼［29］、肾脏细胞［30］中均证实调控AMPK/SIRT1 通路可活化AMPK，激活SIRT1 和PGC-1α，抵消过度累积的ROS，调节线粒体能量代谢，对抗氧化应激，改善线粒体功能。

雷公藤对生殖系统有较强毒性，其提取物可抑制卵巢细胞增殖，诱导卵母细胞和颗粒细胞凋亡，加速卵泡消耗趋向枯竭［31-32］，是制备卵巢功能减退的常用造模方法。本实验结果显示，雷公藤甲素可引起大鼠动情周期紊乱，减少生长卵泡和黄体数，升高血清FSH 水平，降低AMH 和INHB 水平，与DOR 临床表现及辅助检查具有较高拟合度，提示DOR 疾病模型建立成功。而新加苁菟丝子汤给药后，大鼠部分恢复动情周期，各阶段卵泡数增加，血清激素水平得到改善，卵巢功能得以恢复；且给药后大鼠卵巢线粒体结构损伤较轻，ROS 累积减少，ATP 合成增加并恢复MMP 水平，说明其可有效纠正线粒体形态损伤和功能障碍。此外，新加苁菟丝子可上调AMPK、SIRT1 和PGC-1α 蛋白表达，说明新加苁蓉菟丝子汤可通过活化AMPK及其下游因子SIRT1 和PGC-1α 发挥线粒体保护作用。

综上所述，新加苁蓉菟丝子汤可通过激活AMPK/SIRT1 信号通路，纠正卵巢组织线粒体形态损伤和功能障碍，改善性激素紊乱，促进卵泡生长发育，延缓生殖衰老。但本实验未探究线粒体生成等质量控制机制，并且未提取颗粒细胞和线粒体精确研究，后续可进一步深入探索完善相关分子生物学机制。