南天竹根HPLC 指纹图谱建立及其成分分析

吴志瑰，刘 婧，高雅柔，黄 潇，阚 瑞，彭财英，付小梅*，裴建国，刘应蛟，李 玲，张 舟，李紫微，夏紫微

（1.江西中医药大学药学院，江西 南昌 330004； 2.范崔生全国名中医传承工作室，江西 南昌 330006；3.江西中医药大学资产处，江西 南昌 330004）

南天竹为常绿灌木，嫩叶或冬季叶呈红色，作为南方行道绿化植物或庭院观赏植物而被大量栽培［1］。南天竹根药用最早见于《本草纲目拾遗》，又名土黄连、山黄连、山黄芩等，《福建中草药》《广西中药志》 《湖南药物志》 《重庆草药》 等记载其作为民间草药用，主治肺热咳嗽、百日咳、湿热黄疸、食积腹泻、风湿痹痛等［2］。

邱志洁等［3］对南天竹根浸液的急性毒理进行研究，每日最大给药剂量为122.4 g/kg （相当于临床用量的195.8 倍），小鼠生存状况良好，未出现明显的致毒反应，表明南天竹根的使用安全可靠。课题组对南天竹根的生药学及其药理作用进行研究，发现南天竹根对As2O3所致的肝、肾脏毒性有较好的保护作用，是拮抗As2O3毒性的新的优势资源［4-7］。南天竹根在民间应用广泛，但其发挥药效的化学成分不明确，有效成分的含量测定报道极少。本实验对12 个产地南天竹根指纹图谱及总生物碱、小檗碱含量进行研究，同时采用UPLC-QTOF-MS/MS 法对南天竹根的总提取物进行化学成分鉴定，为其质量标准的建立提供依据，为其药效作用及临床应用提供物质基础。

1 材料

12 批南天竹根（S1 ～S12） 产于江西、山东、重庆等地，经江西中医药大学付小梅教授鉴定为南天竹NandinadomesticaThunb.的干燥根，凭证标本保存于江西中医药大学中药鉴定教研室。

KQ-250 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； Waters e2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）； HH-4 型数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）； DLSB-5/20 型低温冷却液循环泵（杭州康雨医疗器械有限公司）； S224S 型电子天平［赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］；116 型摇摆式粉碎机（瑞安市永历制药机械有限公司）； UV-2100 型紫外分光光度仪（上海美谱达仪器有限公司）； Nexera UPLC LC-30A 型超高效液相色谱仪（日本岛津公司）； Triple TOF 5600＋型四极杆飞行时间质谱仪（美国AB Sciex 公司）。

小檗碱对照品（纯度98.8%，合肥博美生物科技有限责任公司）。氢氧化钠、溴甲酚绿（天津市化学试剂研究所有限公司）。色谱纯甲醇、乙腈（德国Merck 公司）； 分析纯甲醇、乙酸、三乙胺（国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 HPLC 指纹图谱建立 参考文献［8］ 报道。

2.1.1 色谱条件 Agilent ODS-A 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相乙腈 （A） -0.2% 乙酸（三乙胺调pH 至5.0） （B），梯度洗脱 （0 ～10 min，10% ～13%A； 10～17 min，13%A； 17 ～18 min，13% ～23% A； 18 ～33 min，23% A； 33 ～45 min，23% ～65%A； 45～60 min，65% ～74%A）； 体积流量1 mL/min； 柱温30 ℃； 检测波长365 nm；进样量2 μL。

2.1.2 供试品溶液制备 将南天竹根置于50 ℃烘箱中干燥，粉碎，过3 号筛，取0.5 g，加入25 mL 甲醇，称定质量，超声处理30 min，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤纸过滤，取续滤液，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.1.3 精密度试验 按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得小檗碱峰面积RSD 为0.34%，表明仪器精密度良好。

2.1.4 稳定性试验 按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，于0、1、3、5、12、24 h 在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得小檗碱峰面积RSD 为0.88%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.5 重复性试验 精密称取同一产地南天竹根粉末6 份，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得小檗碱峰面积RSD 为0.50%，表明该方法重复性良好。

2.1.6 图谱生成 按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A） ” 设置第9 批样品为参照，时间窗宽度为0.1，剪切前5 min 溶剂峰后，采用多点校正后进行自动匹配，得到共有指纹图谱（图1），相似度见表1。由此可知，12 批样品中有9 个共有峰，保留时间RSD均小于1%，相似度在0.920 ～0.996 之间，并且确认了其中5 个共有峰，即1 号峰为金罂粟碱，2 号峰 为 1-hydroxy-2，9，10-trimethoxy-7H-dibenzo［de，g］ quinolin-7-one，5 号峰为去氢南天宁碱，7 号峰为南天竹宁碱，8 号峰为小檗碱。

表1 相似度测定结果Tab.1 Results of similarity determination

图1 12 批南天竹根HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints for twelve batches of Nandinae Radix

2.2 成分鉴定 采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 法。

2.2.1 色谱条件 YMC-Ultra HT Pro C18色谱柱（100 mm×2.0 mm，2 μm）； 流动相0.1%甲酸＋10 mmol 乙酸铵（A） -乙腈（B），梯度洗脱（0 ～8 min，12% ～20% B； 8 ～15 min，20% B； 15 ～20 min，20% ～25% B； 20 ～35 min，25% ～60% B；35～40 min，60% ～95%B）； 体积流量0.3 mL/min；柱温35 ℃； 检测波长365 nm； 进样量2 μL。

2.2.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）； 负离子扫描； 质量扫描范围m/z50 ～1 250； 喷雾电压-4 500 V； 雾化气温度550 ℃； 气帘气、雾化气、辅助气压力55 psi （1 psi ＝6.895 kPa）； 去簇电压-100 V。采用TOF-MS-IDA-MS/MS 法采集数据，TOF/MS 一级预扫描、二级扫描TOF/MS/MS 离子累积时间300.0、100.0 ms； 碰撞能量-35 eV，叠加（-35±15） eV。

2.2.3 结果分析 将相关数据导入Peakview 软件中，基于高分辨质谱的精确分子量信息，并结合二级碎片、文献［9-17］ 报道进行确认，总离子流图见图2，共鉴定出41 个化合物，其中23 个为生物碱，具体见表2。

表2 南天竹根中化学成分鉴定结果Tab.2 Results of chemical constituent identification in Nandinae Radix

图2 正离子模式下南天竹根UPLC-Q-TOF-MS/MS总离子流图Fig.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS total ion flow diagram of Nandinae Radix under positive ion mode

2.3 总生物碱、小檗碱含量测定 参考文献［18-19］ 报道。

2.3.1 酸料染料制备

2.3.1.1 0.05 mol/L 氢氧化钠溶液 精密称取氢氧化钠0.2 g，置于100 mL 量瓶中，蒸馏水溶解并定容至刻度，即得。

2.3.1.2 溴甲酚绿缓冲液 精密称取溴甲酚绿0.5 g，加入14 mL 0.05 mol/L 氢氧化钠溶解，转移至1 000 mL 量瓶中，加水定容至刻度，即得。

2.3.2 供试品溶液制备

2.3.2.1 总生物碱含量测定 将南天竹根置于50 ℃烘箱中干燥，粉碎，过3 号筛，精密称取1 g，置于100 mL 具塞锥瓶中，精密加入甲醇-盐酸（100 ∶1） 混合溶液30 mL，密塞，超声处理30 min，4 000 r/min 离心10 min，取上清液至60 mL 分液漏斗中，加水至0.4 mL，加入24 mL 溴甲酚绿溶液，摇匀，加入12 mL 三氯甲烷，密塞剧烈振摇5 min，静置分层20 min，取三氯甲烷层，即得。

2.3.2.2 小檗碱含量测定 精密称取小檗碱对照品0.5 g，加入25 mL 甲醇，称定质量，超声处理30 min，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤纸过滤，取续滤液，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.3.3 测定方法 采用紫外-分光光度计法测定总生物碱含量，以试剂为空白，测定供试品、对照品溶液在410 nm 波长处的吸光度。采用HPLC 法测定小檗碱含量，色谱条件为Agilent ODS-A 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相乙腈（A） -0.2%乙酸（三乙胺调pH 至5.0）（B），梯度洗脱（0～30 min，10% ～45% A）； 体积流量1 mL/min；柱温30 ℃； 检测波长365 nm； 进样量20 μL。

2.3.4 线性关系考察

2.3.4.1 总生物碱 精密称取小檗碱对照品25.0 mg，置于25 mL 量瓶中，甲醇定容，得到1 mg/mL贮备液，甲醇稀释至不同质量浓度，分别取0.4 mL，置于60 mL 分液漏斗中，加入24 mL溴甲酚绿溶液，摇匀，加入12 mL 三氯甲烷，密塞，剧烈摇晃5 min，静置分层20 min，取三氯甲烷层，以三氯甲烷为空白，在410 nm 波长处测定吸光度（A）。以小檗碱质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A） 进行回归，得方程为A＝27.017X＋0.194 1 （R2＝0.999 9），在3 ～20 μg/mL范围内线性关系良好。

2.3.4.2 小檗碱 精密称取小檗碱对照品25.00 mg，置于5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得到5 mg/mL 贮备液，甲醇稀释至不同质量浓度，在“2.3.3” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标 （X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，得方程为Y＝18 579 872.779 0X-120 009.104 5 （R2＝0.999 9），在0.025 ～0.8 mg/mL范围内线性关系良好。

2.3.5 方法学考察 分别对总生物碱、小檗碱含量测定方法进行精密度、重复性、稳定性、加样回收率试验，测得RSD 分别为0.95%、0.49%，2.30%、0.50%，2.82%、0.28%，1.31%、1.55%，均符合相关要求。

2.3.6 样品含量测定 按“2.3.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3.3” 项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3、图3。

表3 总生物碱、小檗碱含量测定结果Tab.3 Results of content determination of total alkaloids and berberine

图3 小檗碱HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of berberine

2.4 主成分分析（PCA）、判别分析（DA） 共有峰峰面积见表4。

表4 共有峰峰面积测定结果Tab.4 Results of peak area determination of common peaks

2.4.1 PCA 采用SIMCA 14.1 软件对共有峰数据进行PCA 分析，共发现5 个主成分，具体见表5，其中前2 个主成分累积方差贡献率只有0.629，对整个模型的解释度不够。得分散点图见图4，可知各批样品区分效果不理想。

表5 PCA 结果Tab.5 Results of PCA

图4 PCA 得分散点图Fig.4 Score scatter chart for PCA

2.4.2 判别分析（DA） 将共有峰数据分为栽培组和野生组，进行DA 分析，发现2 组数据的1 个判别函数贡献率为100%，但P值为0.563，即差异无统计学意义，表明各批样品未显示出野生、栽培的差异性。

3 讨论

3.1 流动相选择 分别采用甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%乙酸（三乙胺调pH 5.0） 对同一批样品进行梯度、等度洗脱。结果，在乙腈-0.2% 乙酸 （三乙胺调pH 5.0） 系统中，各色谱峰分布、形状、分离度均优于甲醇-水（酸水）、乙腈-水（酸水），故选择乙腈-0.2%乙酸（三乙胺调pH 5.0） 作为流动相。

3.2 提取条件优化 本实验从提取溶剂、提取方式、提取时间3 个方面进行优化，最终确定为甲醇超声处理30 min。提取溶剂考察了30%甲醇、50%甲醇、70% 甲醇、甲醇及30% 乙醇、50% 乙醇、70%乙醇、乙醇，发现甲醇提取时含量高于其他溶剂提取时。提取方式考察了超声、回流，发现超声提取效果优于回流提取。提取时间考察了20、25、30、35、40 min。最终确定，甲醇超声处理30 min作为提取条件。

3.3 HPLC 指纹图谱分析 本实验建立了南天竹根指纹图谱方法，确定了江西、江苏、浙江、河南、山东等10 个省12 个产地的南天竹根药材的指纹图谱，相似性评价结果为0.920～0.996，表明每批药材主要色谱峰相似度很高； 在9 个共有峰中，确定了5 个色谱峰的归属，均为异喹啉类生物碱，其中1-hydroxy-2，9，10-trimethoxy-7H-dibenzo ［de，g］quinolin-7-one、去氢南天宁碱、南天竹宁碱为阿朴菲类异喹啉类生物碱，这类生物碱具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化等活性，临床上用于治疗结肠癌、宫颈癌等疾病，是极为重要的生物碱类型。金罂粟碱、小檗碱为小檗碱类异喹啉生物碱。南天竹指纹图谱的建立为该药材的真伪优劣鉴定、质量控制及临床安全有效的应用提供了有力的保障。

3.4 总生物碱、小檗碱含量测定结果分析 12 个不同产地的南天竹根总生物碱、小檗碱含量差异均比较大，栽培的南天竹根的总生物碱、小檗碱含量普遍高于野生的。各产地总生物碱含量的平均值为29.07 mg/g，范围在13.698 ～46.211 mg/g 之间，含量排在前三的依次为江苏南京、江西南昌、四川成都，均为栽培的南天竹根，含量最高的江苏南京产的是最低的重庆产的3.37 倍。各产地小檗碱含量的平均值为8.48 mg/g，范围在3.627 ～14.151 mg/g 之间，含量排在前三的依次为四川成都、河南信阳、山东青岛，均为栽培的南天竹根，含量最高的四川成都产的是最低的福建泉州产的3.9 倍。

小檗碱占总生物碱的百分数排前三的分别为58.98% （山东青岛）、52.41% （河南信阳）、40.11% （四川成都）； 小檗碱是黄连、黄柏等常用中药的有效成分，具有抗菌、抗病毒、抗病原微生物、降血脂、降血糖、抗肿瘤、保护心脏、抗炎、免疫抑制、抗阿尔茨海默病等活性，课题组首次发现小檗碱具有拮抗As2O3毒性的作用，对国内外治疗急性早幼粒细胞白血病的首选靶向药物亚砷酸氯化钠注射液等砷剂药物产生的肝及肾的毒副作用具有减毒增效的作用。小檗碱也称为黄连素，广泛存在于小檗科、罂粟科、毛茛科、芸香科、防己科等科中的小檗属、十大功劳属、黄连属、唐松草属黄柏属、古山龙属等十余个属内的植物，较常见的药材有黄连、黄柏、三颗针等，南天竹的野生及栽培资源均非常丰富，为小檗碱单体的来源提供了新的物美价廉的优质资源。

3.5 南天竹根差异性分析 12 批南天竹根的27个指纹图谱共有峰数据通过PCA、DA 分析，均不能得出野生南天竹和栽培南天竹的差异性。由于南天竹野生植物生长以及栽培遍布全国各地区，并无道地性植物的记载，因此推测其生长可能不受到产地以及栽培方式的影响，故此无法以PCA、DA 分析对成分数据进行区分。同时由于成分决定药效，因此也能说明野生和栽培南天竹在药用上并无无明显差异，具有较大的潜力和较好的前景。

4 结论

本实验对南天竹根的甲醇提取物的化学成分进行鉴定，共发现41 个化合物，其中23 个为生物碱，再建立10 个省、12 个产地6 批野生、6 批栽培南天竹根的指纹图谱，同时测定其总生物碱、小檗碱含量，为南天竹根优势资源产区及其开发利用提供了依据，也为其质量标准建立提供了坚实的物质基础。