灯盏花乙素磷脂复合物脂微球质量评价

罗 田，贺智勇，茅向军，2，沈祥春，陶 玲*，许乾丽，3*

［1.贵州医科大学药学院，贵州省天然药物资源高效利用工程中心（贵州省高等学校天然药物药理与成药性评价特色重点实验室，贵州医科大学-贵阳市联合重点实验室，天然药物资源优效利用重点实验室），贵州 贵阳 550025； 2.贵州省药品监督管理局检查中心，贵州 贵阳 550081； 3.贵州省食品检验检测院，贵州 贵阳 550004］

药品质量检验方法是保证药品合格性的关键［1］，进一步发展药品质量检验方法具有一定意义。灯盏花乙素是从菊科植物灯盏花中提取出的主要活性成分［2］，具有抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集、保护血管内皮等作用［3-5］，可用于治疗各种心脑血管疾病［6-8］。但该成分脂水溶解性差，生物利用度低，导致相关传统剂型限制了其临床应用。

脂微球递送系统是平均粒径为200 nm 的亚微乳递送系统，作为一种新型药物转运系统具有选择性蓄积于炎症部位的特点和优势［9］。课题组前期根据文献［10-12］ 报道，先将灯盏花乙素制成磷脂复合物以提高其脂溶性，再进一步将其制成脂微球，以期为开发可更好透过血脑屏障的相关制剂提供参考。

另外，乳剂中游离脂肪酸过高会导致心力衰竭、高血压、2 型糖尿病［13-15］； 油相容易氧化产生过氧化物，破坏人体细胞膜的正常生理功能，引发安全问题［16］，故游离脂肪酸含量、过氧化值、甲氧基苯胺值等是衡量脂肪乳质量的重要指标。为了保障灯盏花乙素磷脂复合物脂微球安全性，本实验测定上述指标以建立该制剂质量控制方法。

1 材料

85-2B 型恒温加热磁力搅拌器（金坛市科析仪器有限公司）； ME104/02 型电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海） 有限公司］； PB-10 型PH 计（德国赛多利斯公司）；BS-223S 型电子天平 （北京赛多利斯仪器有限公司）；KQ3200 型超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）；UltiMate 3000 型高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher 公司）； NanoBrook 90Plus PALS 型激光粒度仪（美国布鲁克海文仪器公司）。

灯盏花乙素对照品（成都克洛玛生物科技有限公司，批号CHB18060，纯度≥95%）。注射用大豆磷脂、蛋黄卵磷脂（上海太伟药业股份有限公司）； 注射用中链脂肪酸甘油三酯、注射用甘油（浙江遂昌惠康药业有限公司）；注射用大豆油（浙江田雨山药用油有限公司）； 泊洛沙姆188 （F-68，西安悦来医药科技有限公司）； 对甲氧基苯胺（萨恩化学技术有限公司）； 棕榈酸（梯希爱上海化成工业有限公司，纯度≥97.0%）； 油酸、四氢呋喃（西陇科学股份有限公司）。乙腈、甲醇为色谱纯（美国天地公司）。

2 方法与结果

2.1 磷脂复合物制备 根据文献［10-12］ 报道和课题组前期优化结果，精密称取灯盏花乙素原料药0.6 g、大豆磷脂1.8 g，溶于20 mL 混合溶剂（甲醇∶四氢呋喃＝1 ∶1）中，35 ℃水浴恒温冷凝回流2.5 h，减压回收溶剂，加入适量二氯甲烷以充分溶解大豆磷脂、磷脂复合物，过0.22 μm 微孔滤膜，适量二氯甲烷冲洗滤膜，合并滤液、洗液，减压除去二氯甲烷，即得，干燥12 h，收集滤膜上的沉淀，计算复合率，公式为复合率＝ ［（W总-W沉） /W总］ ×100%（W沉为未复合灯盏花乙素沉淀量，W总为灯盏花乙素投药量），结果为（93.21±1.09）%。

2.2 脂微球制备 称取F-68 0.3 g、注射用甘油1.25 g，分散于适量超纯水中，65 ℃磁力搅拌混合均匀，作为水相； 称取蛋黄卵磷脂0.6 g、中链脂肪酸甘油三酯3.75 g、大豆油1.25 g、油酸0.25 g，磷脂复合物25 mg，超声溶解，作为油相，用注射器将油相缓慢加到水相中，高速剪切得初乳，稀NaOH 调节pH 值，待温度降至室温后进行均质，即得。同法制备不含磷脂复合物的空白脂微球。

2.3 灯盏花乙素含量测定 采用HPLC 法。

2.3.1 色谱条件 Ultiamte®LP-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相乙腈-0.2%磷酸（20 ∶80）； 体积流量1.0 mL/min； 柱温30 ℃； 检测波长334 nm； 进样量10 μL。

2.3.2 溶液制备

2.3.2.1 对照品溶液 精密称取灯盏花乙素对照品10 mg，置于50 mL 量瓶中，适量甲醇溶解并定容，得0.2 mg/mL贮备液，精密吸取1 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3.2.2 供试品溶液 精密吸取脂微球乳液0.8 mL，置于10 mL 量瓶中，加适量甲醇超声破乳溶解，定容，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3.2.3 空白溶液 精密吸取空白脂微球溶液0.8 mL，置于10 mL 量瓶中，加适量甲醇超声破乳溶解，定容，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3.3 方法学考察

2.3.3.1 专属性试验 精密吸取对照品、供试品、空白溶液各10 μL，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，辅料对测定无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 灯盏花乙素HPLC 色谱图

2.3.3.2 线性关系考察 精密吸取贮备液0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、6.40 mL，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，制成系列质量浓度，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积（Y） 对质量浓度（X） 进行回归，得方程为Y＝0.417X-0.112 7 （r＝0.999 8），在1～128 μg/mL 范围内内线性关系良好。

2.3.3.3 精密度试验 取对照品溶液适量，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得灯盏花乙素峰面积RSD为0.95%，表明仪器精密度良好。

2.3.3.4 重复性试验 精密吸取脂微球6 份，按“2.3.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，测得灯盏花乙素含量RSD 为1.35%，表明该方法重复性良好。

2.3.3.5 稳定性试验 精密吸取脂微球乳液0.8 mL，置于10 mL 量瓶中，按“2.3.2.2” 项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、6、8、10、12 h 在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，测得灯盏花乙素峰面积RSD 为2.22%，表明溶液在12 h 内稳定性良好。

2.3.3.6 加样回收率试验 精密吸取空白脂微球0.8 mL，共9 份，置于10 mL 量瓶中，分别精密加入200 μg/mL 贮备液100、125、150 μL，按“2.3.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，灯盏花乙素平均加样回收率分别为89.85%、97.52%、92.98%，RSD 分别为1.87%、1.12%、0.35%。

2.3.4 样品含量测定 精密量取脂微球乳液3 份，按“2.3.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，计算含量。结果，灯盏花乙素平均含量为（35.77±0.14） μg/g。

2.4 外观形态观察 所得脂微球为乳白色，在透射电镜下呈球形或类球形，流动性良好，分布均一，见图2。

图2 灯盏花乙素磷脂复合物脂微球透射电镜图

2.5 专属性试验 取对照品、供试品溶液适量，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定。结果，两者中灯盏花乙素色谱峰保留时间一致，均为7.46 min，并且分离度理想，表明该方法专属性良好。

2.6 pH 值测定 制备3 批样品，按照2020 年版《中国药典》 四部（通则0631） 测定pH 值，结果为7.00 ～7.05，符合人体pH 值。

2.7 粒径测定 取脂微球乳液适量，适量水稀释后加到样品池中，测定其粒径，结果平均值为（160.59±4.46） nm，见图3。

图3 灯盏花乙素磷脂复合物脂微球粒径分布

2.8 酸值测定 称取脂微球适量，按照2020 年版《中国药典》 四部 （通则0713） 测定酸值，结果平均值为（0.94±0.01） mg/g。

2.9 甲氧基苯胺值测定 参考文献［17］ 报道。

精密称取脂微球5 g，置于50 mL 圆底烧瓶中，加20 mL无水乙醇，60 ℃水浴减压旋转蒸发15 min，重复3次以除尽水分，加异丙醇-异辛烷混合溶液（2 ∶8） 使残渣溶解，转移至25 mL 量瓶中，混合溶液稀释至刻度，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。

精密吸取上述供试品溶液、混合溶液各5 mL，分别置于甲、乙2 支10 mL 具塞试管中，精密加入含0.25%对甲氧基苯胺的冰醋酸溶液1 mL （当天制备，以异丙醇-异辛烷为参比，1.00 cm 比色池，在350 nm 波长处测定吸光度，其数值不得大于0.2），振摇，避光放置10 min，以乙管中溶液为空白，采用紫外-可见分光光度法在350 nm 波长处测定甲管中样品溶液吸光度； 另取供试品溶液适量，以混合溶液为空白，在350 nm 的波长处测定吸光度A0。结果，3 批样品中甲氧基苯胺值分别为0.81、0.77、0.83，未超过5.0，均符合限度要求。

2.10 游离脂肪酸含量测定 参考文献［18］ 报道。

精密称取棕榈酸（因处方中含有油酸，故称取量为0.153 9 g），置于50 mL 量瓶中，正庚烷稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

精密吸取上述对照品、“2.3.2.2” 项下供试品溶液各1 mL，置于10 mL 具塞试管中，加入异丙醇-正庚烷-0.5 mol/L 硫酸混合溶液（40 ∶10 ∶1） 5.0 mL，振摇1 min，静置10 min，供试品溶液中精密加入正庚烷、水各3 mL，对照品溶液中精密加入正庚烷2 mL、水4 mL，密塞，上下翻转10 次，静置至少15 min 分层，精密量取上层液3 mL，置于10 mL 离心管中，加尼罗蓝指示液l mL，在通氮气条件下用氢氧化钠滴定液滴至溶液显淡紫色，规定供试品溶液消耗氢氧化钠滴定液（0.01 mol/L） 体积不得大于对照品溶液消耗氢氧化钠滴定液（0.01 mol/L） 体积。结果，3批样品中游离脂肪酸含量分别为3.61、3.49、3.61 mmol/L，未超过7 mmol/L，均符合限度要求。

2.11 过氧化值测定 参考文献［19］ 报道。取三氯甲烷-冰醋酸混合溶液（2 ∶3） 30 mL，置于150 mL 碘量瓶中，通氮气10 min，精密称取脂微球5.0 g，迅速加到碘量瓶中，盖上塞子轻轻振摇，精密加入碘化钾饱和溶液0.5 mL，密塞避光，振摇萃取3 min，加新沸并放冷的水30 mL，Na2S2O3滴定液（0.01 mol/L） 滴定并充分振摇直至黄色消失，加淀粉指示液5 mL，Na2S2O3滴定液（0.01 mol/L）滴定并充分振摇至紫蓝色消失，同时进行空白试验校正，规定消耗的Na2S2O3滴定液（0.01 mol/L） 体积不得超过1.0 mL。结果，3 批样品过氧化值分别为0.56、0.40、0.40 mmol/kg，未超过6 mmol/kg，均符合限度要求。

2.12 有关物质检查 参考文献［20］ 报道。

2.12.1 色谱条件 同“2.3.1” 项。

2.12.2 破坏性试验 未破坏： 精密吸取“2.3.2.2” 项下供试品溶液1.0 mL，置于25 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，再精密吸取1 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度。

酸破坏： 精密吸取 “2.3.2.2” 项下供试品溶液1.0 mL，置于150 mL 锥形瓶中，加入1 mol/L 盐酸10 mL，加热回流4 h，冷却，甲醇反复洗涤后移至25 mL 量瓶中，精密吸取1 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，作为酸破坏产物。

碱破坏： 精密吸取 “2.3.2.2” 项下供试品溶液1.0 mL，置于150 mL 锥形瓶中，加入1 mol/L 氢氧化钠10 mL，加热回流4 h，冷却，甲醇反复洗涤后移至25 mL 量瓶中，精密吸取1 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，作为碱破坏产物。

氧化破坏： 精密吸取 “2.3.2.2” 项下供试品溶液1.0 mL，加入30%过氧化氢10 mL，静置2 h，精密吸取1 mL至10 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，作为氧化产物。

热破坏： 精密吸取 “2.3.2.2” 项下供试品溶液1.0 mL，置于坩埚中，放到150 ℃烘箱中干燥2 h，冷却，甲醇反复洗涤后移至25 mL 量瓶中并定容，精密吸取1.0 mL至10 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，作为热解产物。

2.12.3 结果分析 图4B、4C、4E 显示，灯盏花乙素色谱峰完全消失，其前后无杂质峰出现，表明脂微球在酸性、碱性、高温条件下均被破坏，而且无相关杂质产生； 图4D显示，灯盏花乙素色谱峰峰面积减小，说明脂微球在氧化条件下稳定性较差。

图4 破坏性试验HPLC 色谱图

3 讨论与结论

2020 年版《中国药典》 规定，当待测成分含量小于100 μg/g 时，其加样回收率限度为85% ～110%，而本实验测得3 批灯盏花乙素磷脂复合物脂微球中原料药平均含量为（35.77±0.14） μg/g，加样回收率为89.85% ～97.52%，符合上述要求。另外，该制剂粒径范围为46.60 ～564.75 nm，平均值为160 nm，并且90%的乳滴粒径均在1 μm 以下，未检测出＞5 μm 者［21］，表明其分布范围合理。

在游离脂肪酸含量、过氧化值测定过程中均通入氮气，可避免从空气中导入额外的氧化产物而产生误差。在甲氧基苯胺测定过程中采用少量多次的方法加入乙醇，并减压回收该溶剂以除尽水分，可防止相关氧化物质干扰，并控制氧含量。在灯盏花乙素磷脂复合物制备过程中采用四氢呋喃、二氯甲烷、甲醇，三者均属于二类有机溶剂。

文献［22］ 报道，在差示扫描量热法检测过程中残留溶剂会升温吸热，产生吸热峰。但课题组前期发表的灯盏花乙素磷脂复合物表征文献中，热分析结果显示未产生其他明显吸热峰，故本实验未对其溶剂残留进行检测。

在有关物质检查过程中，酸碱破坏选择回流方式，可减少加热过程中溶剂挥发及反应物混入生成物中，从而提高相关杂质的纯度。

综上所述，上述方法检测灵敏度高，专属性强，重复性好，可较好地评价灯盏花乙素磷脂复合物脂微球质量。