银杏二萜内酯葡胺对阿尔茨海默病大鼠学习记忆障碍的改善作用

王 颖，王 强，蒋珍秀，陈 军，雒 彧

（1.兰州大学第一医院神经内科，甘肃 兰州 730000； 2.兰州大学基础医学院病理生理学研究所，甘肃 兰州 730000）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD） 又称老年痴呆，是一种最常见的老年慢性神经退行性疾病，65 岁以上人群发病率约11%，85 岁则达到了32%［1］，患者晚期丧失生活自理能力，给其亲属和家庭带来严重的经济负担，影响社会发展［2］。目前，仍然没有合适的临床药物能防治AD，现有的也只能延缓发病。作为多病因神经退行性疾病，AD 的治疗具有多靶点性［3-4］。

银杏叶为银杏科植物银杏的叶，有敛肺气、平喘咳功效，用于治疗心悸怔忡、肺虚咳喘。现代药理研究证明，银杏提取物具有神经保护作用，对学习记忆障碍和老年痴呆症具有一定的防治作用。银杏内酯是银杏叶提取物的主要活性成分，银杏二萜内酯葡胺注射液主要成分为银杏内酯，由银杏内酯 A （35%）、B （60%）、C （2%）、K（2%） 等二萜内酯组成［5］。已有研究表明，银杏二萜内酯葡胺能改善缺血再灌注大鼠脑缺血引起的行为缺陷，降低谷氨酸、天冬氨酸等兴奋性氨基酸水平，增加γ-氨基丁酸等抑制性神经递质的释放，并通过calpain 通路抑制神经细胞凋亡［5-8］。银杏二萜内酯葡胺能激活PI3K/Akt/Nrf2 信号通路，发挥抗氧化和保护神经细胞的作用［9-10］。课题组前期研究表明，银杏二萜内酯葡胺能减轻老年小鼠脑内的炎症反应，增强自然衰老小鼠学习记忆功能［11］。但银杏二萜内酯葡胺对AD 影响的研究较少，本研究通过建立AD 大鼠模型，探讨银杏二萜内酯葡胺对AD 大鼠认知功能障碍的影响，并对其相关分子机制作进一步研究。

1 材料

1.1 动物 清洁级SD 大鼠，3 月龄，雌雄各半，体质量230～270 g，由兰州大学实验动物中心提供［实验动物生产许可证号SCXK （甘） 2018-0002］，饲养于温度20～24 ℃、自然光照的实验环境，自由进食、饮水。本研究涉及的动物实验操作均遵守兰州大学实验动物饲养和使用规范。

1.2 试剂与药物 银杏二萜内酯葡胺注射液 ［批号181005，5 mL （25 mg） /支，江苏康缘药业股份有限公司］。Aβ1-42（批号171596，美国Sigma 公司）； 兔单克隆抗体NMDA 受体2B （NR2B）、兔单克隆抗体NMDA 受体2Bphospho S1248 （p-NR2B）、鼠单克隆抗体p44/p42 MAPK（ERK1/2）、兔多克隆抗体p44/p42 MAPK- Thr202/Tyr204（p-ERK1/2） （货号145445、5355S、4696S、9101S，美国Cell Signaling Technology 公司）； 鼠单克隆抗体钙调蛋白依赖蛋白激酶（calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）、兔多克隆抗体CaMKⅡ-phospho T286 （p-CaMK Ⅱ）、兔多克隆抗体cAMP 反应结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）、兔单克隆抗体CREB-phospho S133（p-CREB）、兔多克隆抗体PSD95、兔单克隆抗体脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、兔多克隆抗体TrkB、兔单克隆抗体TrkB-phospho Y705 （p-TrkB）、鼠单克隆抗体β-actin （货号ab22609、ab32678、ab31387、ab32096、ab18258、ab108319、ab18987、ab229908、ab8226，英国Abcam 公司）； IRDyeTM（800CW）染料标记的羊抗鼠/兔二抗（美国LI-COR 公司）。

1.3 仪器 Odyssey 近红外双色激光成像系统（美国LICOR 公司）； WM-100 型水迷宫视频分析系统（成都泰盟软件有限公司）。

2 方法

2.1 分组、造模及给药 将大鼠（雌雄各半） 随机分为假手术组、模型组和银杏二萜内酯葡胺低、中、高剂量组，每组8 只。假手术组行脑立体定位注射手术，但不注射任何药物，其余各组大鼠侧脑室注射Aβ1-42（5 nmol/L） 建立AD 模型。造模后第2 天，银杏二萜内酯葡胺低、中、高剂量组大鼠分别尾静脉注射1.5、3.0、6.0 mg/kg 银杏二萜内酯葡胺，假手术组和模型组大鼠尾静脉注射等量生理盐水，连续4 周。给药结束后进行Morris 水迷宫实验，第1～6 天为学习能力检测，第7 天为记忆能力检测。实验结束后处死大鼠，分离脑组织海马体。

2.2 脑立体定位注射Aβ1-42大鼠腹腔注射6% 水合氯醛（30 mg/kg） 进行麻醉，仰卧位固定在脑立体定位仪上，剃去头部毛发并进行消毒，纵向切开皮肤暴露前囟颅骨，根据大鼠立体定位图谱的侧脑室坐标点（前囟后1.4 mm、矢状线旁左侧1.5 mm、深4 mm） 进行注射，注射速度0.2 μL/min，注射完毕后留针5 min，再缓慢移出注射器，缝合头皮并消毒，将大鼠从脑立体定位仪上取下，放回饲养笼中待苏醒。

2.3 Morris 水迷宫实验 参考Morris 等［12］报道方法设置水迷宫圆柱形水箱直径1.6 m，水温23～25 ℃，测试平台固定于第三象限内水面下2.0 cm。第1～6 天进行定位航行实验，每天在固定时间训练4 次，在每个象限的固定点将大鼠面向水池壁放入水箱中，60 s 内让其自由游动并寻找隐藏的平台，记录找到平台时间（逃避潜伏期），并让其在平台上停留休息20 s； 如果60 s 内找不到平台（逃避潜伏期记为60 s），则由实验人员将其引导到平台上并停留休息20 s。第7 天进行空间探索实验，撤除平台，将大鼠于第一象限放入水池中，在60 s 内使用视频跟踪系统软件描记其游动路径轨迹图，记录穿越平台次数、在目标象限停留时间、游程比例。

2.4 蛋白免疫印迹法检测蛋白表达 将大鼠海马体于冰浴条件下使用电动匀浆机进行匀浆，加入组织裂解液提取总蛋白，12 000 r/min 离心10 min，收集上清液，BCA 法测定样品蛋白浓度，于-80 ℃保存备用。取部分蛋白样本，加入上样缓冲液煮沸10 min 变性。蛋白样本经聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转至NC 膜，加4%脱脂牛奶-TBS 溶液室温封闭1 h，加一抗4 ℃孵育过夜，洗膜后加入兔或鼠IgG 荧光二抗室温孵育1 h，加入ECL 发光试剂，使用奥德赛扫描成像系统扫描免疫印迹条带，检测并记录条带的相对灰度值。

2.5 统计学分析 通过SPSS 16.0 软件进行处理，数据以（±s） 表示，组间比较采用单因素方差分析，检验水准α＝0.05。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 银杏二萜内酯葡胺对大鼠学习记忆能力的影响 由表1 可知，水迷宫定位航行实验第2 天起，与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期延长（P＜0.01），学习能力下降；与模型组比较，银杏二萜内酯葡胺中、高剂量组逃避潜伏期缩短（P＜0.01），学习能力增强。由表2 可知，与假手术组比较，模型组大鼠穿越平台次数、目标象限停留时间和游程比例均降低（P＜0.01），记忆能力下降； 与模型组比较，银杏二萜内酯葡胺中、高剂量组大鼠穿越平台次数、目标象限停留时间和游程比例增加（P＜0.01），记忆能力增强。

表1 银杏二萜内酯葡胺对大鼠逃避潜伏期的影响（s，±s，n＝8）

表1 银杏二萜内酯葡胺对大鼠逃避潜伏期的影响（s，±s，n＝8）

注： 与假手术组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃＃P＜0.01。

组别第1 天第2 天第3 天第4 天第5 天第6 天假手术组56.352±3.54342.045±2.48135.534±3.05331.376±3.53523.621±4.37516.036±2.682模型组58.542±2.05456.654±2.241** 48.854±1.614** 44.582±3.402** 36.853±3.225** 33.278±5.105*银杏二萜内酯葡胺低剂量组 56.358±2.05855.542±2.82145.357±4.68142.258±2.31236.571±2.35730.365±2.482银杏二萜内酯葡胺中剂量组 55.245±1.65248.351±1.852＃＃40.243±2.256＃＃34.365±2.351＃＃26.358±1.251＃＃ 21.874±1.632＃＃银杏二萜内酯葡胺高剂量组 56.851±2.02646.778±2.225＃＃41.527±3.324＃＃35.667±2.629＃＃26.278±3.244＃＃ 22.823±3.624＃＃

表2 银杏二萜内酯葡胺对大鼠穿越平台次数、目标象限停留时间、游程比例的影响（±s，n＝8）

表2 银杏二萜内酯葡胺对大鼠穿越平台次数、目标象限停留时间、游程比例的影响（±s，n＝8）

注： 与假手术组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃＃P＜0.01。

组别穿越平台次数/次目标象限游程比例/%目标象限停留时间比例/%假手术组5.254±0.21456.654±1.51457.084±3.811模型组3.674±0.651**39.028±2.743**40.110±2.892**银杏二萜内酯葡胺低剂量组3.852±0.25440.521±1.95441.645±1.657银杏二萜内酯葡胺中剂量组4.580±0.361＃＃47.368±2.036＃＃49.921±2.641＃＃银杏二萜内酯葡胺高剂量组4.636±0.547＃＃48.625±3.012＃＃50.541±3.325＃＃

3.2 银杏二萜内酯葡胺对大鼠海马组织NR2B、ERK1/2、CaMKⅡ、CREB 蛋白表达的影响 由图1、表3 可知，与假手术组比较，模型组大鼠海马组织p-NR2B、p-ERK1/2、p-CaMKⅡ、p-CREB 蛋白表达降低（P＜0.01）； 与模型组比较，银杏二萜内酯葡胺中、高剂量组大鼠海马组织p-NR2B、p-ERK1/2、p-CaMK Ⅱ和p-CREB 蛋白表达升高（P＜0.01）。

图1 各组大鼠海马组织NR2B、ERK1/2、CaMKⅡ、CREB 蛋白条带

表3 银杏二萜内酯葡胺对大鼠海马组织NR2B、ERK1/2、CaMKⅡ、CREB 蛋白表达的影响（±s，n＝8）

表3 银杏二萜内酯葡胺对大鼠海马组织NR2B、ERK1/2、CaMKⅡ、CREB 蛋白表达的影响（±s，n＝8）

注： 与假手术组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃＃P＜0.01。

组别p-NR2B/NR2Bp-ERK1/2/ERK1/2p-CaMKⅡ/CaMKⅡp-CREB/CREB假手术组1.067±0.1461.004±0.0830.992±0.1331.013±0.087模型组0.618±0.029**0.624±0.022**0.665±0.026**0.651±0.015**银杏二萜内酯葡胺低剂量组0.652±0.030**0.629±0.013**0.710±0.036**0.661±0.042**银杏二萜内酯葡胺中剂量组0.815±0.053＃＃0.796±0.045＃＃0.902±0.030＃＃0.857±0.081＃＃银杏二萜内酯葡胺高剂量组0.876±0.034＃＃0.883±0.064＃＃0.827±0.071＃＃0.832±0.047＃＃

3.3 银杏二萜内酯葡胺对大鼠海马组织PSD95、BDNF、TrkB 蛋白表达的影响 由图2、表4 可知，与假手术组比较，模型组大鼠海马组织PSD95、BDNF、p-TrkB 蛋白表达降低（P＜0.01）； 与模型组比较，银杏二萜内酯葡胺中、高剂量组大鼠海马组织PSD95、BDNF 和p-TrkB 蛋白表达升高（P＜0.01）。

图2 各组大鼠海马组织PSD95、BDNF、TrkB 蛋白条带

表4 银杏二萜内酯葡胺对大鼠海马组织PSD95、BDNF、TrkB 蛋白表达的影响（±s，n＝8）

表4 银杏二萜内酯葡胺对大鼠海马组织PSD95、BDNF、TrkB 蛋白表达的影响（±s，n＝8）

注： 与假手术组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃＃P＜0.01。

组别PSD95BDNFp-TrkB/TrkB假手术组1.033±0.1761.002±0.0890.998±0.114模型组0.648±0.038**0.636±0.041**0.778±0.050**银杏二萜内酯葡胺低剂量组0.703±0.051**0.695±0.052**0.721±0.087**银杏二萜内酯葡胺中剂量组0.961±0.053＃＃0.905±0.043＃＃0.896±0.038＃＃银杏二萜内酯葡胺高剂量组0.970±0.077＃＃0.942±0.021＃＃0.960±0.103＃＃

4 讨论

随着我国快速进入老龄化社会，包括AD 在内的多种神经退行性疾病的发病率持续升高。海马体位于大脑颞叶内，对于记忆、空间定位、定向发挥关键作用，AD 患者海马内嗅皮层区域最先、最易出现损伤［13］。

N-甲基-D-门冬氨酸受体（NMDAR） 家族蛋白属于谷氨酸受体，在脑组织中普遍表达，与包括学习、认知在内的大脑高级功能具有高度的相关性。NMDAR 家族蛋白NR2B 与谷氨酸相互作用，能激活CaMK Ⅱ和细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）信号通路并诱发长时程增强效应（long-term potentiation，LTP）。CaMK Ⅱ和ERK1/2 下游最重要的分子是CREB，CREB 活化（磷酸化水平增强） 也与LTP、记忆的形成相关［14-15］。研究发现在老龄动物模型和AD 动物模型中，NR2B 以及CaMK Ⅱ、ERK1/2、CREB 的活性均下降［16-18］。本研究结果显示，银杏二萜内酯葡胺上调了AD 大鼠海马组织p-NR2B 表达，激活了下游CaMKⅡ/ERK/CREB 信号通路，而该信号通路激活具有促进突触的形成，增强突触可塑性、LTP 等效应。同时水迷宫实验表明银杏二萜内酯葡胺能改善AD 大鼠的学习记忆障碍。

PSD95 是突触后联合的主要构成组件，与学习记忆形成、神经信息传递和突触可塑性等过程具有密切联系，在老年人和阿尔茨海默病患者脑内表达减少［19］。本研究结果显示，银杏二萜内酯葡胺能上调AD 大鼠海马组织PSD95蛋白表达。BDNF 在学习和记忆的形成中发挥重要的作用［20-21］，转BDNF 基因小鼠的认知功能和突触可塑性有明显的提升，而敲除BDNF 基因小鼠则表现出空间学习记忆能力的下降［22-23］。BDNF 能和神经元表面TrkB 结合并激活TrkB 和ERK/CREB 信号通路，在海马刺激突触发生和强化突触间联系、增加树突棘密度和体积大小、参与神经发生、促进突触可塑性、LTP 和记忆的形成中起关键作用。BDNF在海马中的表达和认知功能呈现正相关性，在部分AD 转基因动物和老龄动物的海马中表达降低，且TrkB 的活性受到抑制［24］。本研究结果与上述研究结果一致，AD 大鼠海马组织BDNF 蛋白表达降低，TrkB 信号通路受到抑制（即TrkB 磷酸化水平降低）； 而银杏二萜内酯葡胺则能升高BDNF 蛋白表达并激活TrkB 通路。

综上所述，银杏二萜内酯葡胺可改善AD 大鼠的学习记忆功能，其机制可能与增加突触相关蛋白NR2B 磷酸化水平和PSD95、BDNF 表达，并激活下游CaMK Ⅱ/ERK/CREB 和TrkB 信号通路相关。