高效液相色谱串联质谱法同时测定畜禽粪便中多种抗生素方法的研究

侯 轩,陈 凯,裘丞军,虞一聪,王 彬,吴望君,陆春波

(浙江省动物疫病预防控制中心,浙江 杭州 311999)

目前,畜禽粪便中检测抗生素的方法主要有高效液相色谱法[1-2]、液相色谱串联质谱法[3-4],但关于同时检测四环素类、磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类药物的方法鲜有报道。本研究采用高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法对四环素类、磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类26种化合物进行同时检测,为畜禽粪便中抗生素残留有效监控、粪污无害化处理及资源化利用提供重要的技术支撑。

1 材料与方法

1.1试验仪器 高效液相色谱仪、串联三重四极杆质谱仪、冷冻干燥机、电子天平、氮吹仪(N-EVAP);冷冻离心机、振荡器等。

1.2试剂 26种化合物标准品(磺胺氯哒嗪、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺二甲嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、丹诺沙星、双氟沙星、洛美沙星、氟甲喹、泰乐菌素、替米考星、土霉素、四环素、金霉素、多西环素)均购于Witega公司,纯度≥90.0%。

1.3试验方法

1.3.1仪器条件

1.3.1.1色谱条件 用十八烷基键合硅胶色谱柱(Waters C183 μm 3.0×150 mm),柱温30 ℃,进样量5 μL,0.2%甲酸水溶液为流动相A,乙腈为流动相B,按表1进行梯度洗脱,流速为0.3 mL/min。

表1 梯度洗脱程序表

1.3.1.2质谱条件 电喷雾源正离子模式(ESI+),多反应监测模式(MRM);离子源电压:4 500 V,辅助加热气温度:500 ℃,气帘气流速:10 L/h;离子源气流流速:Gas1为50 L/h,Gas2为35 L/h;26种化合物的MRM条件参数见表2。

1.3.2溶液配制 预先配制1 mol/L氢氧化钠溶液、0.2%甲酸水溶液、Mcllvaine-Na2EDTA提取液。

1.3.3标准品储备液配制 分别精密称取四环素类、磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类26种化合物约10 mg,置10 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,分别配制成1.0 mg/mL标准品储备液。

1.3.4混合标准品中间工作液配制 分别吸取适量的26种化合物标准品储备液,置于100 mL棕色容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,混匀,使之成1.0 μg/mL的混合标准品中间工作液。

1.3.5混合基质匹配工作液配制 取鸡、猪不含待测化合物的空白粪便,加入混合标准品中间工作液适量,按提取和净化步骤处理后,用0.2%甲酸水复溶分别制成浓度为5、10、50、100、150、200 ng/mL的混合基质匹配工作液。

1.3.3样品预处理

1.3.3.1样品的制备 取新鲜粪便约500 g,-40 ℃以下冷冻干燥12 h后,粉碎或研磨,过0.5 mm孔径的分析筛,装入密封容器中,试样在-20 ℃干燥避光保存备用。

1.3.3.2样品的提取 取粉碎后的粪便2.0 g(±0.2 g),置于50 mL的离心管中。加入20 mL Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液,振荡涡旋1 min,超声15 min后,10 000 r/min离心5 min后,取全部上清液作为备用液1。残渣用1%乙酸乙腈20 mL重复提取一次,转移上清液为备用液2。

1.3.3.3样品的净化 将HLB固相萃取柱依次用甲醇5 mL和水5 mL活化,将全部备用液1过柱,控制流速在1.0 mL/min以下,用水3 mL淋洗,抽干,8 mL 5%氨水化甲醇洗脱,收集洗脱液。洗脱液与备用液2混合后,40 ℃水浴条件下,氮气吹干,用0.2%甲酸水溶液2.0 mL溶解残余物,溶液经0.22 μm过微孔滤膜,上机测定。

2 结果与分析

2.1质谱条件的优化 以0.1%甲酸水∶乙腈∶甲醇=1∶1∶1(V/V/V)为基准流动相,采用流动注射泵连续进样,对26种药物的质谱条件进行优化,在正离子模式下进行全扫描,确定各种药物在多反应监测模式下信号采集的特征离子对(表2)。

2.2液相条件的优化 为了获得较好的色谱峰型,本研究对色谱柱及流动相进行了优化。采用“1.3.1.1”所述色谱柱及流动相条件,色谱行为良好,能满足检测要求。从空白样品、基质加标样品的MRM色谱图(图1～4)可见,在待测药物出峰的位置没有杂质干扰,各化合物实现了良好的基线分离及响应。

图1 空白猪粪便基质溶液总离子流图

图2 空白鸡粪便基质溶液总离子流图

图3 26种化合物猪粪便基质加标溶液总离子流图(20 ng/mL)

图4 26种化合物鸡粪便基质加标溶液总离子流图(20 ng/mL)

图5 磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶保留时间

2.3标准曲线、检出限及定量限 按1.3.3处理空白样品后,高效液相色谱串联质谱检测,以峰面积作为纵坐标,浓度为横坐标绘制标准曲线。由表3可知,在浓度为5～200 ng/mL浓度范围内,线性关系良好,r2>0.99,取信噪比S/N=3的样品浓度为方法检出限(LOD),取信噪比S/N=10 的样品浓度为方法定量限(LOQ)。

表3 26种化合物的线性方程与相关系数

2.4回收率与精密度 在3个不同浓度添加水平下进行添加回收实验,每个浓度设5个平行,重复3次。计算添加回收率及变异系数,结果见表4～5。

表4 猪粪中26种化合物的回收率(n=5)

表5 鸡粪中26种化合物的回收率(n=5)

2.5实际样品检测 应用建立的分析方法,对浙江省内20家养殖场采集的30份生猪粪便、20份鸡粪便进行测定,结果表明,4大类化合物在猪、鸡粪便中均有不同程度检出。四环素类检出含量范围在10.5～264 200 μg/kg之间;磺胺类检出含量范围在5.2～10 510 μg/kg之间;喹诺酮类检出含量范围在7.2～5 952 μg/kg之间;大环内酯类检出含量范围在8.6～7 096之间。整体来看,猪粪便中26种化合物检出含量高于鸡粪便中检出含量。本方法能满足对畜禽粪便中26种化合物有效监控的需要。

3 讨论

3.1流动相梯度洗脱程序的优化 因待测26种化合物中,磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶为同分异构体,分子式均为C11H12N4O3S,其母离子m/z均为281.1,定量离子m/z为156.1,单单通过质荷比很难将三种化合物区分,本研究通过对不同流动相条件的摸索,确定了流动相梯度洗脱程序(表1),对待测化合物进行采集分析。由图6可见,磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶的保留时间分别为9.52、9.93、10.84 min,三种化合物在该流动相条件下得到有效分离,且峰形锐利,满足检测要求。

图6 猪粪便基质效应(ME)

3.2前处理方法的优化 夏天娇[2]、石奥[4]等研究粪便中四环素类药物时,采用Mcllvaine-Na2EDTA溶液进行提取。主要原因是粪便中的Ca2+、Mg2+、Fe3+等金属离子,可与四环素类化合物的酚羟基,形成难溶的螯合物[5]。Mcllvaine-Na2EDTA溶液可有效抑制基质中金属离子对目标化合物的络合反应[6]。但仅使用Mcllvaine-Na2EDTA溶液提取,喹诺酮类、磺胺类、大环内酯类药物回收率较差,故本研究选择有机相溶剂进行二次提取。在有机相溶剂选择上,对甲醇、乙腈、1%乙酸乙腈进行了比较,研究发现当乙腈作为提取液时,相比甲醇,可有效降低上机液中的蛋白质类杂质;相对纯乙腈提取,1%乙酸乙腈提取,可提高喹诺酮类药物的回收率。故本研究采取Mcllvaine-Na2EDTA溶液提取,HLB小柱净化,1%乙酸乙腈进行二次提取的前处理方法。结果表明,26种化合物回收率在70.1%～99.1%之间,符合检测要求。

3.3样品的基质效应考察 基质效应MEs是影响HPLC-MS/MS分析复杂药物时重要的因素之一。基质效应(MEs)是根据纯标准溶液与基质标准溶液的响应强度进行评估,考察某水平下,标准溶液的响应强度Ssolvent和同条件下基质标准溶液的响应强度Smatrix的关系,具体公式如下:ME%=(Smatrix-Sblank)/Ssolvent,其中,Sblank为空白基质提取液的响应强度。MEs值介于0.85和1.15之间认为无明显的基质效应,大于1.15表明是基质增强,小于0.85表明是基质抑制。本研究通过比较标准品溶液和猪粪便基质匹配标准溶液(浓度20 ng/mL)对目标物响应值的影响,来确定基质对目标物有无基质效应,结果见图6。

从图6可见,本研究中大部分化合物呈现基质抑制现象,有可能是因为粪便样品基质较为复杂,经水相和有机相提取后,上机液中杂质在ESI离子源作用下与目标化合物竞相离子化,降低了目标化合物的响应。因此本研究采用基质加标校准曲线进行定量计算,以减小基质效应对目标化合物定量的影响。

4 结论

本研究建立的畜禽粪便中四环素类、磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类26种化合物的检测方法,回收率在70.1%～99.1%之间,日内变异系数范围为1.3%～13.0%,日间变异系数范围为1.6%～14.7%。本方法操作简便,灵敏度高,重现性强,符合兽药残留分析性能要求,可用于日常样品分析。