不同频率摩腹对脾虚型功能性消化不良家兔胃肠动力的调控规律及其与CaM-MLCK信号通路相关性研究

张强 王继红 黄志凯 蔡伟蓝 任雪晗 许嘉英

功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)是临床上常见的功能性胃肠疾病之一,全球发病率约为8%～30%[1],迄今为止尚无特异性治疗方法[2]。近年来的研究表明FD的发病与胃肠动力障碍密切相关。摩腹可改善胃肠动力,治疗FD疗效确切[3-5]。前期研究表明,摩腹的频率不同,其治疗效应亦会随之改变,但其对胃肠动力的作用规律和机制尚未明确[6-8]。因此,本研究尝试从调控胃肠道平滑肌收缩的经典通路——钙调蛋白—肌球蛋白轻链激酶(caImodulin-myosin light chain kinase,CaM-MLCK)信号通路着手,观察不同频率摩腹对脾虚型FD家兔胃肠动力的调控规律,分析其调控作用与CaM-MLCK信号通路的相关性,探讨摩腹的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年新西兰家兔60只,由山东康大生物科技有限公司提供[动物合格证号:SCXK(鲁)20160002],雌雄各半,体质量(2.0±0.5)kg。所有家兔在广州中医药大学科技产业园动物房饲养,室温条件(21±3)℃ ,相对湿度保持在(35±2)%,保持昼夜光照正常及饲养环境安静。

1.2 仪器与试剂

实验采用疆越科技研制730C型人工智能机械臂(DOBOT 魔术师/型号:DT-MG-4R005-02E)、TEKSCAN压力测试调制器(上海邑成测试设备有限公司生产)、MFF多点薄膜压力传感器、校对器、动态数据采集器、家兔固定器(上海化科实验器材,PVC-01)、兔解剖台、解剖器械。试剂包括环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cMAP)酶联免疫吸附试剂盒(品牌:Elabscience;货号:E-EL-0056c)、三磷酸肌醇(inositol triphosphate,IP3)酶联免疫吸附试剂盒(品牌:FineTest;货号:EU3119)、P物质(Substance P,SP)定量检测试剂盒(ELISA)(品牌:茁彩生物;货号:ZC-52333-J)、腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)含量检测试剂盒(品牌:索莱宝;货号:BC0305;规格:100t/96s)及总一氧化氮(nitric oxide,NO)检测试剂盒(品牌:碧云天;货号:S0023)。

1.3 实验分组

适应性喂养7天后,将60只家兔随机分为空白组、模型组、低频摩腹治疗组、高频摩腹治疗组、低频摩腹+抑制剂组及高频摩腹+抑制剂组,每组10只。其中空白组正常喂养,不予造模,不施加手法干预,其余5组全部造脾虚FD模型。其中模型组不施加手法干预;低频摩腹治疗组的摩腹频率为101～150次/分钟;高频摩腹治疗组的频率为201～250次/分钟;低频摩腹+抑制剂组在低频摩腹治疗的基础上加予腹腔注射肌球蛋白轻链激酶抑制剂(ML 9 hydrochloride,ML-9);高频摩腹+抑制剂组在高频摩腹治疗的基础上加予腹腔注射ML-9。实验过程中存在部分家兔死亡导致数据脱落的情况,最终采集到的数据分布为:空白组、高频摩腹治疗组、低频摩腹+抑制剂组家兔,各8只,模型组及低频摩腹治疗组家兔各7只,高频摩腹+抑制剂组家兔9只;纳入统计的家兔样本总量为47只。

1.4 动物造模

本实验采用苦寒泻下法及饥饱失常法造脾虚FD家兔模型[9]。第1～9天:将大黄35 g、厚朴27 g、枳实18 g置于装有650 mL蒸馏水的药锅中浸泡30分钟,煮沸45分钟,用纱布及滤纸过滤药渣,用烧瓶盛装过滤好的药液,用70℃的恒温旋转蒸发仪将烧瓶中的药液浓缩至1 g/mL,共80 mL,根据家兔体重用注射器按6 mL/kg灌胃给药,隔日一次;第10～12天:灌饲大黄番泻叶芒硝合剂(每12 mL药液含大黄6 g、番泻叶3 g、芒硝1 g),根据家兔体重,按12 mL/kg给药,灌胃频率每日一次;第13～18天:灌饲大黄番泻叶芒硝合剂(每18 mL药液含大黄6 g、番泻叶3 g、芒硝1.2 g),根据家兔体重,按18 mL/kg给药,灌胃频率每日一次。灌胃期间喂食饲料量减半。造模期间观察记录家兔精神、体重、进食量及大便的变化和行为学改变,经家兔行为学量表评估所示各组样本均符合脾虚模型标准,造模成功。

1.5 干预方法

人工智能机械臂端安装拟人硅胶手指并连接控温器,使硅胶手指保持在人体正常体温范围(36～37℃),两名助手分别握持家兔前后肢,将其仰卧位束缚于操作台上,充分暴露腹部,使机械臂指端轻落于施术穴位,在MFF多点薄膜压力测试系统下使指端与穴位皮肤间压力固定为100 mN,摩腹方向保持一致,设置低频摩腹治疗组及低频摩腹+抑制剂组摩腹频率为101～150次/分钟,高频摩腹治疗组及高频摩腹+抑制剂组频率为201～250次/分钟,每只家兔每穴推5分钟,共计15分钟,每日1次。低频摩腹+抑制剂组及高频摩腹+抑制剂组每日手法治疗后均进行腹腔注射ML-9(2 mg/kg),连续干预10天。(家兔穴位定位参照《实验针灸学》对家兔取穴方法[10],中脘穴:前腹部正中线上,剑状软骨与脐连线中点处;天枢穴:脐旁开三厘米处。手法干预前各组家兔均已备皮并标记穴位。)

1.6 样本处理及指标检测

所有家兔于干预结束次日禁食24小时(不禁水),第三日早上用2.5 mL含有5%炭末和2%羧甲基纤维素钠(Carboxymethylcellulose sodium,CMC-Na)的混悬液对所有家兔进行灌胃,于灌胃结束半小时后采用空气栓塞法处死家兔,剖开腹腔,将家兔小肠肠管(幽门至回盲部)完整取出并测量长度,此即小肠总长度,测量炭末前沿距离幽门部的长度,得炭末推进长度,根据小肠推进率(%)=(炭末推进长度/小肠总长度)×100%计算各组家兔的小肠推进率。测量完小肠总长度及炭末推进率后取下家兔小肠组织及胃组织各一块,每只家兔小肠组织取样部位为空肠,胃组织取样部位为胃窦。将样本剪碎置于空白管中,按重量制成组织匀浆,取上清液保存于冰箱,用相应试剂盒分别检测胃组织中NO、SP、IP3、ATP、cAMP的含量和肠组织中IP3、ATP、cAMP的含量。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组家兔小肠推进率的比较

与空白组相比,模型组小肠推进率显著降低(P<0.01)。与模型组相比,低频摩腹治疗组、低频摩腹+抑制剂组及高频摩腹+抑制剂组小肠推进率显著升高(P<0.01),高频摩腹治疗组与模型组相比无统计学差异(P>0.05)。低频摩腹+抑制剂组与低频摩腹治疗组、高频摩腹+抑制剂组与高频摩腹治疗组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组家兔小肠推进率

2.2 各组家兔胃组织NO、SP含量的比较

胃组织NO含量的比较:与空白组相比,模型组含量显著升高(P<0.01);与模型组相比,低频摩腹治疗组含量下降(P<0.05),其余手法干预组均无统计学差异(P>0.05);低频摩腹+抑制剂组与低频摩腹治疗组相比、高频摩腹+抑制剂组与高频摩腹治疗组相比,胃NO均升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组家兔胃组织NO、SP、IP3、ATP、cAMP含量比较

胃组织SP含量的比较:与空白组相比,模型组含量显著下降(P<0.01);与模型组相比,高频摩腹治疗组与高频摩腹+抑制剂组含量均升高(P<0.05),低频摩腹治疗组及低频摩腹+抑制剂组含量显著升高(P<0.01);低频摩腹+抑制剂组与低频摩腹治疗组、高频摩腹+抑制剂组与高频摩腹治疗组相比无统计学差异(P>0.05)。见表2。

2.3 各组家兔胃肠组织IP3、ATP、cAMP含量的比较

胃肠组织IP3含量的比较:模型组与空白组相比差异无统计学意义(P>0.05);与模型组相比,摩腹干预后的四组小肠组织IP3含量均显著下降(P<0.01);低频摩腹+抑制剂组与高频摩腹+抑制剂组胃、肠组织IP3含量均显著下降(P<0.01)。见表2、表3。

表3 各组家兔小肠组织IP3、ATP、cAMP含量比较

胃肠组织ATP含量的比较:与空白组相比,模型组肠ATP含量下降(P<0.05),模型组胃ATP含量显著下降(P<0.01);与模型组比,高频摩腹治疗组肠ATP含量升高(P<0.05)、胃ATP含量无统计学差异(P>0.05),低频摩腹治疗组胃、肠ATP含量均显著升高(P<0.01);与低频摩腹治疗组相比,低频摩腹+抑制剂组胃、肠ATP含量均显著下降(P<0.01);与高频摩腹治疗组相比,高频摩腹+抑制剂组胃ATP含量下降(P<0.05)、肠ATP含量显著下降(P<0.01)。见表2、表3。

胃肠组织cAMP含量的比较:与空白组相比,模型组肠cAMP含量升高(P<0.05),胃cAMP含量显著升高(P<0.01);与模型组相比,低频摩腹治疗组胃、肠cAMP含量均显著下降(P<0.01),高频摩腹治疗组胃、肠cAMP含量均无统计学差异(P>0.05),低频摩腹+抑制剂组及高频摩腹+抑制剂组含量胃、肠cAMP均显著升高(P<0.01)。见表2、表3。

3 讨论

当胞内Ca2+水平受信号刺激升高到一水平时,钙调蛋白(caImodulin,CaM)与Ca2+的结合体(Ca2+-CaM)将与肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)结合,激活CaM-MLCK信号通路(见图1),使肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)磷酸化,活化肌球蛋白ATP酶,触发纤丝滑动,并使ATP水解供能,引起平滑肌收缩[11]。当胞内Ca2+浓度下降,Ca2+-CaM复合物减少或解离,引起MLC去磷酸化,则平滑肌松弛;与此同时,cAMP可活化cAMP依赖性蛋白激酶A(protein kinase A,PKA),通过cAMP/PKA途径引起平滑肌松弛[12]。IP3通过与IP3受体结合促使钙池操纵性钙内流(store-operated Ca entry,SOCE)的发生,钙池耗竭并触发胞外Ca2+的内流,促进激活CaM-MLCK信号通路。NO是消化系统中的抑制性神经递质,可通过环磷酸鸟苷/蛋白激酶G(cyclic guanosine monophosphate/protein kinase G,cGMP/PKG)途径或抑制胞内Ca2+浓度升高而使平滑肌松弛。SP属于兴奋性神经肽, 可直接或通过激活磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)促进IP3的产生而间接使消化道平滑肌收缩;ML-9可直接抑制MLCK活性,也可通过抑制SOCE降低胞内Ca2+浓度从而阻断CaM-MLCK信号通路。

注: 本图为笔者据相关研究资料绘制。

既往研究提示,部分健脾中药方可通过影响CaM-MLCK信号通路从而影响平滑肌收缩,促进胃肠动力[13-15]。在推拿干预消化疾病研究方面,张玮等[16]和石玉生等[17]通过一项腹部推拿干预非酒精性脂肪肝病大鼠的随机对照试验证实腹部推拿可以影响MLCK的表达,调控MLCK信号通路,从而改变肠道黏膜功能。前期研究曾尝试探索腹部一指禅推法对脾虚家兔的作用及其与MLCK信号通路的关系,但尚未发现确切联系,指出一指禅推法可能通过多通路多途径影响胃肠道功能[18-19]。

本研究在前期研究的基础上进一步增加样本量与检测指标。研究结果显示,家兔经造模后,除胃肠组织IP3外,其余检测指标均发生明显变化。摩腹干预结果提示,低频摩腹治疗组、低频摩腹+抑制剂组及高频摩腹+抑制剂组小肠推进率均显著提高。低频摩腹治疗组逆转造模所致各项指标水平变化的效果显著,其中降低胃肠cAMP含量、升高胃SP含量的效果尤佳;高频摩腹治疗组也可升高胃SP含量,但对造模后其余指标的变化几乎无改善作用甚至部分变化有加重趋势。在CaM-MLCK信号通路被抑制的情况下,低频摩腹+抑制剂组胃NO含量与胃肠cAMP含量的变化与模型组相似;低频摩腹+抑制剂组及高频摩腹+抑制剂组胃SP含量升高效果均与相应单纯摩腹治疗组无差异。值得一提的是,在造模并未影响胃肠IP3含量的基础上,低频摩腹治疗组与高频摩腹治疗组肠IP3含量下降,低频摩腹+抑制剂组及高频摩腹+抑制剂组的胃肠组织IP3含量呈显著下降趋势。

综上所述,摩腹对胃肠动力的影响存在频率—效应规律,摩腹在101～150次/分钟频率段时可显著促进胃肠动力,当频率超过200次/分时,摩腹对胃肠动力无改善作用,甚至有损害趋势。通过比较,摩腹调控胃肠动力的机制可能如下:(1)摩腹通过降低胃肠组织中NO及cAMP的含量,抑制cAMP/PKA途径及cGMP/PKG途径,减少对Ca2+-CaM的竞争性消耗,从而促进上游CaM-MLCK信号通路中Ca2+、Ca2+-CaM与MLCK的结合。(2)当CaM-MLCK信号通路被阻断后,一方面,摩腹可通过提高家兔胃SP含量,发挥其促进胃肠动力的直接效应;另一方面,IP3的显著下降提示,阻断CaM-MLCK信号通路,可能增加IP3的消耗促使SOCE发生,从而改变胞内Ca2+水平,激发Ca2+介导的其它信号通路,使胃肠动力受到影响。其具体机制仍需进一步深入研究。本研究主要从侧面探讨了摩腹对胃肠动力的调控机制及与CaM-MLCK信号通路的关系,涉及指标及相关通路范围较大,今后的研究尚需缩窄定位,对摩腹干预下CaM-MLCK信号通路上CaM、MLCK、MLC各物质的具体变化以及胃肠道平滑肌运动学改变等进行检验,以期进一步明确摩腹调控胃肠动力的具体机制。