高效液相色谱法测定营养补充剂中吡啶甲酸铬*

吴 燕

(福建省产品质量检验研究院，国家加工食品质量检验检测中心，福建 福州 350015)

铬是人体必需的一种微量元素，主要参与脂肪、碳水化合物的代谢[1]。铬包含二价、三价和六价形式，其中三价铬的稳定性最高。据报道，作为葡萄糖耐受因子的重要组成部分，三价铬可以通过促进胰岛素受体信号传导来增强胰岛素敏感性[2-3]，因此铬的缺失可能会引发一系列代谢疾病，比如糖尿病和心血管疾病等。吡啶甲酸铬[4-6]是三价铬和吡啶甲酸络合形成的有机化合物，是色氨酸的天然衍生物，易被人体吸收，常常作为膳食补充剂和饲料添加剂。吡啶甲酸铬属于脂溶性非电解质，可顺利通过细胞膜直接作用于组织[7-9]。研究表明，吡啶甲酸铬不仅能改善糖代谢[10]，还可以稳定血糖水平。然而，吡啶甲酸铬对胰岛素作用的确切分子机制尚不清楚[11]。

营养补充剂通常是指以补充维生素、矿物质而不以提供能量为目的的产品。近年来，富含吡啶甲酸铬的营养补充剂在市场上愈发火热，作为国家市场监督管理局允许的功能因子之一，吡啶甲酸铬已被广泛添加到营养补充剂中。但是，美国糖尿病协会指出，糖尿病或肥胖患者补充铬的益处尚未得到明确证明，同时铬(III)化合物在世界卫生组织国际癌症研究机构公布的3类致癌物清单中，其安全性和临床功效始终存在争议[12]。国家食品药品监督管理局发布的《营养素补充剂申报与审评规定(试行)》规定[13]，三价铬(Cr3+)的成人每日推荐摄入量为15～150 μg，因此准确测量营养补充剂中吡啶甲酸铬的添加量是非常有必要的。目前国内外针对营养补充剂中吡啶甲酸铬检测的文献较少，我国的检测依据主要是国标GB/T 5009.195-2003[14]，但是针对成分复杂的样品往往达不到准确定量需求。本研究通过高效液相色谱建立针对营养补充剂中吡啶甲酸铬的定量方法，该法具有高效便捷，成本低、灵敏度高等特点，希望为营养补充剂中吡啶甲酸铬的监管提供技术支撑。

1 实 验

1.1 材料与仪器

吡啶甲酸铬(纯度>96.0%)，永乐生物科技有限公司；甲醇、乙腈(色谱纯)，默克公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾(分析纯)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；实验用水均为超纯水。

高效液相色谱仪(Waters e2690)，美国沃特世公司；超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；高速离心机，赛默飞世尔科技公司；分析天平，赛多利斯科学仪器公司；超纯水仪，默克公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

对片剂或者胶囊样品进行粉碎处理，称取0.5 g样品加入等比例的水和甲醇并定容至20 mL，超声提取20 min，之后 4 500 r/min离心5 min，用0.45 μm有机滤膜过滤后备用。

1.2.2 标准溶液配置

精确称量吡啶甲酸铬标准品0.002 0 g，加入等比例的水和甲醇并定容至10 mL，超声至溶解。此时溶液中每毫升含200 μg吡啶甲酸铬。稀释得到1 mg/L，2 mg/L，5 mg/L，50 mg/L，100 mg/L 系列标准溶液，用于标准曲线的绘制。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.125 mol/L磷酸盐缓冲溶液中含有20%(V/V)乙腈，检测波长：254 nm，柱温为室温，进样量为10 μL，流速为0.5 mL/min，洗脱时间15 min。

1.3 方法应用

应用该方法对市售的含吡啶甲酸铬的营养补充剂样品进行测试，每份样品重复3次。

2 结果与分析

2.1 提取条件优化

2.1.1 提取剂浓度优化

由于吡啶甲酸铬微溶于水，通常选择甲醇作为提取溶剂，同时选择合适的提取剂比例可以有效提升吡啶甲酸铬的提取效率。本实验分别选用不同比例的甲醇溶液对样品进行提取，对比其提取效果找出最佳比例。由表1可得，随着提取剂浓度的升高，吡啶甲酸铬的提取率呈现先升高后下降的趋势，所以选择最佳的提取比例是甲醇∶水=1∶1。

表1 提取剂浓度对方法的影响

2.1.2 超声时间选择

超声可以大大加快溶剂的萃取，因此超声时间也是影响提取效率的重要因素。本实验考察了不同的超声时间对样品中吡啶甲酸铬的提取效果。结果如表2所示，超声时间的延长促进吡啶甲酸铬的提取，当时间在20～40 min之间样品提取的吡啶甲酸铬无明显差异，说明此时吡啶甲酸铬已经超声提取充分，因此选择20 min作为最佳超声时间。

表2 超声时间对方法的影响

2.2 方法学验证结果

2.2.1 线性范围、检出限和定量限

将吡啶甲酸铬标准溶液稀释成不同浓度的标准曲线工作液，上机进样后由色谱柱分离，紫外检测，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标进行线性拟合，得标准曲线及线性相关系数(R2)。图1为吡啶甲酸铬标品色谱图，出峰时间为10.4 min。结果表明，回归方程为y=27 629.21x+2 660.14，相关系数为0.999 99，表明吡啶甲酸铬在1～100 μg/mL 范围内呈现良好的线性关系。以信噪比S/N=3确定检出限(LOD)，并以信噪比S/N=10为定量限(LOQ)，方法的检出限为1.4 mg/kg，定量限为4.68 mg/kg。

图1 吡啶甲酸铬标品色谱图

2.2.2 精密度、回收率和稳定性

将已知量的吡啶甲酸铬标准溶液加入阴性样品中，加标量为高、中、低3个水平，按照上述方法完成3个浓度水平、7个平行样品加标试验。通过计算测定值的RSD，并计算回收率来评估方法的准确性。结果如表3所示，吡啶甲酸铬的回收率为100%～101%，相对标准偏差在0.33%～3.08%之间，说明该方法具有良好的准确度与精密度，满足吡啶甲酸铬的准确定量需求。

表3 三水平加标回收试验结果

如图2所示为基质样品加标前后萃取色谱图以及空白溶液萃取色谱图，目标物吡啶甲酸铬出峰均无干扰，峰形良好，且与其他物质的色谱峰呈现基线分离，因此可准确定量检测。

图2 空白和加标后样品色谱图

样品按上述方法前处理后分别放置0、4、8、12、24 h 后测定，由表4可得，样品中测得的吡啶甲酸铬含量为293.56～296.43 μg/mL，RSD在4.64～5.16之间，结果无显著差异，说明经本方法处理后的样液在一天内稳定性良好。

表4 样品中吡啶甲酸铬的稳定性(n=3)

2.3 市售样品检测结果

目前市售的含铬营养补充剂主要是胶囊和片剂为主，按上述方法检测采购的营养补充剂样品，结果显示，样品中有吡啶甲酸铬检出，含量范围为11 390～13 220 mg/kg，样品图谱如图3所示。

图3 市售样品色谱图

3 结 论

本研究通过高效液相色谱建立了营养补充剂中吡啶甲酸铬的定量检测方法。该方法前处理操作便捷，能够在15 min内完成吡啶甲酸铬的分离提取，其线性关系与稳定性良好，回收率为100%，吡啶甲酸铬的检出限和定量限分别为1.4 mg/kg和4.68 mg/kg。本方法大大缩短了分析时间，具有较高的精密度与准确度，适合营养补充剂中吡啶甲酸铬的准确定量。