基于CRISPR/Cas系统的生物传感器研究进展

李倩,范高超

(青岛科技大学 化学与分子工程学院,山东 青岛 266042)

聚类规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关酶(Cas)统称为CRISPR/Cas系统。CRISPR/Cas系统是在大肠杆菌中发现的一种天然微生物适应性免疫系统,其主要功能是作为分子剪刀破坏入侵的核酸,通过切割特定的外源DNA或RNA来保护细菌免受外源基因的入侵[1]。近十年来,CRISPR/Cas系统介导的基因编辑已成为最强大的分子生物学工具之一,应用扩展到生命科学的各个角落,广泛用于临床诊断、生物传感和生物成像等领域。

CRISPR/Cas系统由Cas效应器、非编码CRISPR RNA(crRNA)和在某些情况下的反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)组成。crRNA由两部分结构组成,一部分是与Cas效应器结合的发夹结构,另一部分是与目标物特异性识别的“原间隔”基序[2](一般为20个碱基,20 nt)。由于crRNA能特异性识别目标DNA或RNA,所以CRISPR/Cas系统具有极高的特异性,而且不需要传统基因编辑工具中涉及的复杂的蛋白质工程。此外,Cas效应器的特异性核酸酶活性仅在目标识别时触发,可以实现从目标识别到信号转导的无缝过渡。接下来简要概述第2类CRISPR/Cas系统的结构和生物学特性,这类系统包括Cas9、Cas12、Cas13和Cas14。

1 CRISPR/Cas9

1.1 CRISPR/Cas9系统概述

CRISPR/Cas9是第一个用于真核细胞基因编辑的CRISPR/Cas系统,开启了生物化学的一个崭新时代。CRISPR/Cas9系统由三部分组成:化脓性链球菌Cas9(spCas9)、crRNA和tracrRNA。crRNA和tracrRNA可以结合在一起,形成单一的引导RNA(gRNA)[3]。spCas9可通过gRNA靶向下游具有“原间隔邻近基序”(PAM)的20 nt的目标双链DNA(dsDNA)。此时spCas9作为核酸内切酶的活性被激活,可以在PAM的上游对目标dsDNA进行位点特异性裂解。其中,Cas9识别的PAM序列是一段富含G碱基的序列(5’-NGG-3’)。Cas9的特异性由与目标DNA互补的20 nt序列的gRNA决定,而且位于目标序列下游的PAM序列对于Cas9与目标链的识别也至关重要[4]。CRISPR/Cas9的这种特点有助于提高生物分析工具开发的检测特异性。CRISPR/Cas9系统示意图如图1所示。

图1 CRISPR/Cas9系统示意图

1.2 CRISPR/Cas9系统在生物传感中的应用研究

CRISPR/Cas9系统可以作为生物识别的工具。生物识别是生物分析工具的基本组成部分,通过生物识别可以实现核酸、蛋白质和小分子等目标物的特异性检测和成像。CRISPR/Cas9凭借独特的crRNA引导的序列结合特性,目前已成为最常用的生物识别机制之一,可用于体外或生命系统中核酸的高度特异性识别。Pardee等人[5]介绍了这样一项工作,通过将Cas9与基于核酸序列的扩增(NASBA)相结合,设计了一种CRISPR/Cas9生物传感器用以区分寨卡病毒株。寨卡病毒是一种通过蚊虫传播的病毒,最初在非洲发现,后来广泛传播到美洲等地。但美洲寨卡病毒株的亚基因组序列含有一个与Cas9特异性识别的PAM序列,而非洲寨卡病毒株则没有。所以利用CRISPR/Cas9生物传感器可以特异性地切割美洲寨卡病毒基因序列,而不切割非洲寨卡病毒序列,以此来实现这两种病毒的区分。

CRISPR/Cas9系统可以用于基因编辑。Actinomycetal(放线菌)是革兰氏阳性细菌,能够产生各种各样的医学和工业相关的次级代谢产物,例如抗生素、除草剂、化疗药物和免疫抑制剂等,开发具有药物先导特性的放线菌次级代谢产物对医学研究具有重要意义。2015年,Tong等人[6]报道了一种CRISPR/Cas9系统来编辑放线菌基因组。该系统可以对某个基因或基因簇进行特异性地敲除,从而有效和可逆地控制放线菌的基因表达。此外,他们还开发了一种基于催化失活的Cas9变体(dCas9)系统(CRISPR/dCas9),该系统也可以有效和可逆地控制靶基因的表达。Shi等人[7]最近开发了一种高效的CRISPR/Cas9基因组编辑技术,用来改变Starmerellabombicola(球拟假丝酵母菌)的基因组序列,从而生产具有广泛用途的酸型槐糖脂。该CRISPR/Cas9系统通过同源定向修复提高了基因整合和靶基因破坏的效率,实现了多基因同时破坏。还通过在体内组装多个DNA片段进一步构建了一个工程菌株,该菌株可以产生单一的酸型槐糖脂。CRISPR/Cas9提供了一种方便且高效的基因编辑技术,在生物学以及生物医学中具有良好的应用前景。

2 CRISPR/Cas12

2.1 CRISPR/Cas12系统概述

Cas12是Cas家族中一个独特的核酸酶,与Cas9不同的是,它们识别并切割单链DNA(ssDNA)和目标dsDNA,并且在切割dsDNA时产生黏性末端。第一个发现的Cas12酶是Cas12a(也叫Cpf1),是在普雷沃氏菌和弗朗西斯菌的基因组中发现的。Cas12家族的另一个亚型Cas12b(称为C2c1)则是从不同的细菌物种中发现的。Cas12a和Cas12b具有相似的结构,但激活机制上有所不同,Cas12b需要crRNA和tracrRNA来结合靶标,而Cas12a只需要crRNA。LbCas12a(来自拉克诺螺旋菌)和AsCas12a(来自同源酸氨基球菌)的PAM序列为5’-TTTV,而BhCas12b(来自希萨希芽孢杆菌)的PAM序列为5’-ATTN。Cas12与PAM识别之后,dsDNA开始解离,随后解离的目标链与crRNA进行碱基配对。目标链与crRNA杂交后使得Cas12的催化位点转化为活性构型,从而切割目标DNA和附近的非靶ssDNA。这种独特的反式切割(也称为侧边切割)特性使Cas12成为集目标识别和信号放大于一体的强大信号放大器[8]。CRISPR/Cas12系统示意图如图2所示。

图2 CRISPR/Cas12系统示意图

2.2 CRISPR/Cas12系统在生物传感中的应用研究

CRISPR/Cas12a系统可以实现信号扩增检测。Petri等人[9]提出了一种基于重组酶聚合酶扩增反应(RPA)的DETECTR(DNA核酸内切酶靶向CRISPR反转录报告器)检测平台,该平台是一项超灵敏的等温核酸检测技术。在这项工作中,作者发现CRISPR/Cas12a复合物可以识别dsDNA和ssDNA,并诱导靶向特异性侧边切割。而且dsDNA目标物的识别更加严格,需要PAM进行特异性识别以及目标物与crRNA互补,而ssDNA目标物只需要与crRNA互补即可。与PCR相比,DETECTR检测平台通过将Cas12a的侧边裂解特性与RPA结合,可以在37～42 ℃实现等温扩增,而且扩增速度快得多(短至20 min)。

2021年,Zhang等人[10]通过将CRISPR/Cas12a系统和双等温扩增技术结合,建立了一种超灵敏检测橘霉素(Citrinin,CIT)的方法。在该策略中,抗原修饰的金纳米颗粒(AuNPs)通过金硫键将ssDNA连接在AuNPs上,以此形成探针。抗原修饰的AuNPs通过与CIT竞争,结合到涂有抗CIT抗体的磁珠上。经过简单的磁分离后,收集AuNPs,用二硫苏糖醇溶液洗涤后释放ssDNA。ssDNA首先通过指数扩增反应扩增,然后在随后的杂交链式反应中用作引物,产生dsDNA,该dsDNA包含一个PAM序列,CRISPR/Cas12a能对其进行特异性识别,从而激活CRISPR/Cas12a的活性,裂解ssDNA报告基因产生荧光信号。该方法具有较低的检出限(0.127 ng/mL)和较宽的线性范围(0.005～500 μg/mL)。燕麦和面粉中CIT的检测回收率分别为97%～104%和105%～111%,实现了食品毒素的高灵敏度和高选择性检测。

CRISPR/Cas12a系统还可以与电化学传感器相结合,用来开发具有高灵敏度、高特异性、高可编程性和普遍适用性的生物传感器。Qing等人[11]首次将CRISPR/Cas系统引入一个无固定化的电化学生物传感平台,用于灵敏和特异性地检测疾病相关的核酸和小分子。在该策略中,通过模块化滚环扩增(Rolling Circle Amplification,RCA)反应将目标链扩增为一长串通用的DNA触发链,用以激活CRISPR/Cas12a的脱氧核糖核酸酶活性,从而进一步实现信号扩增的目的。靶激活阻滞剂探针的裂解使亚甲基蓝标记的报告探针被还原的氧化石墨烯修饰电极捕获,从而产生显著增加的电化学信号。该电化学生物传感器展示了一种“信号开启”模型,实现了对microRNAs(miRNAs)、细小病毒B19(PB-19)基因序列和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的高灵敏度和特异性检测。

Cas12b属于V-B型CRISPR/Cas系统,是一种嗜热RNA引导的内切酶。与Cas12a相比,其研究应用比较少。Li等人[12]报道了一种基于CRISPR/Cas12b的可用于四种不同应用的HOLMESv2系统。该系统可以特异性识别单核苷酸多态性(SNP);通过恒温一步法与LAMP扩增相结合,可以精确定量目标核酸,而且可以有效避免交叉污染的出现;该方法可以对环状RNA、病毒RNA、人类细胞的mRNA进行简单检测;同时也可以准确定量目标DNA的甲基化程度。实验证明,HOLMESv2系统在分子诊断和表观遗传学应用中具有极大的潜力。

3 CRISPR/Cas13

3.1 CRISPR/Cas13系统概述

Cas13是一类RNA引导的核糖核酸酶,包括4个主要亚型:Cas13a(也叫C2c2)、Cas13b、Cas13c和Cas13d。有研究发现,Cas13家族不需要特定的PAM来进行目标识别。与Cas12相似,Cas13与crRNA以及目标链特异性结合之后,催化位点会转化为活性构型,进而催化近端RNA链的非特异性裂解[13]。Cas13家族的无差别裂解活性也使它们成为生物分析应用的理想信号放大器,而且目前的大多数研究主要是基于Cas13a进行的。CRISPR/Cas13系统示意图如图3所示。

图3 CRISPR/Cas13系统示意图

3.2 CRISPR/Cas13系统在生物传感中的应用研究

CRISPR/Cas13a于2016年被首次报道,是一项有潜力的基因编辑技术。与CRISPR/Cas9系统类似,CRISPR/Cas13a也可用于抑制真核细胞中的基因表达,是一种高效的、特异性的基因治疗工具。Fan等人[14]介绍了一项CRISPR/Cas13a介导的基因治疗技术,靶向治疗膀胱癌中高表达的人血管内皮生长因子受体(VEGFR2)。通过开发一种多功能脂质体系统,将CRISPR/Cas13a系统输送到膀胱癌细胞中。在该策略中,CRISPR/Cas13a仅作为一种用于基因编辑的工具,而不影响细胞内遗传物质的稳定性;该系统可以特异性靶向VEGFR2,具有精确识别目标的能力;而且可以通过近红外光来介导药物系统的释放。这种基于CRISPR/Cas13a的近红外光介导的靶向肿瘤细胞的脂质传递系统为膀胱癌基因治疗开辟了一种新策略,具有极大的应用潜力。

CRISPR/Cas系统还可用于核酸检测。近年来,有研究者报道了一种CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a/d系统,用以检测烟草花叶病毒、烟草蚀刻病毒和马铃薯X病毒三种RNA病毒。该策略可以通过CRISPR/Cas12a系统对PCR扩增产生的病毒DNA扩增序列进行检测,并可以实现对混合感染的植物的多重检测。之后通过调整检测系统,可以绕过昂贵的RNA纯化步骤,利用 CRISPR/Cas13a/d系统可以直接检测病毒RNA,避免了复杂的预扩增步骤。该系统可以在叶片收获后30 min内进行病毒诊断,为开发简单、快速、经济有效的植物病毒检测方法提供了一种新的思路,极大地拓宽了CRISPR/Cas系统在现代农业中的应用。

外泌体miRNAs作为一种癌症诊断的潜在生物标志物,在癌症生物学中起着关键的作用。最近,Zhang等人[15]开发了一种基于CRISPR/Cas13a的脂质体介导的膜融合策略(MFS-CRISPR),该策略可以将CRISPR/Cas13a转染到外泌体中,用以直接测量血浆中的外泌体miRNA-21(miR-21)。脂质体介导的MFS可将荧光信号限制在融合囊泡内,用于外泌体异质性分析。通过临床样本的检测,发现乳腺癌患者与健康人体miR-21表达差异显著,这进一步证明了MFS-CRISPR平台检测的准确性。MFS-CRISPR检测平台具有宽的线性检测范围和低的检测限,而且灵敏度高,操作简单,在癌症诊断和治疗监测方面具有广阔的临床应用前景。

4 CRISPR/Cas14

Cas14于2018年由Doudna等人首次发现,它由400～700个氨基酸组成,Cas14蛋白比较小,其大小是其他Cas蛋白的一半[16]。Cas14家族有3个亚型:Cas14a、Cas14b和Cas14c。Cas14的结构尚未被揭示,但研究表明,所有Cas14亚型都有一个RuvC结构域,负责目标链的切割。而且Cas14也具有反式裂解活性,只切割ssDNA,而不切割dsDNA或单链RNA。Cas14不需要PAM序列,但是Cas14对crRNA与目标序列碱基对错配的耐受性较低,因此与其他Cas蛋白相比具有更高的特异性,可用于核酸序列的检测[17]。有研究表明,Cas14能够很好地区分单核苷酸多态性,比如能够很好地区分决定人类眼镜颜色的HERC2变体。这为拓展Cas14在生物分析领域的应用具有重要意义。

5 结论

CRISPR/Cas系统是最强大的分子剪刀之一,它可以简单、灵活、特异性地识别和切割目标核酸,这是其他分子剪刀(如核酸内切酶和锌指核酸酶)所实现不了的。当用于分析和诊断分析时,CRISPR/Cas系统凭借其独特的特性具有明显的优势[18]。首先,CRISPR/Cas系统通过crRNA间隔区的20个碱基特异性地识别目标核酸,这确保了核酸的序列特异性检测和位点特异性成像,并使脱靶结合或切割最小化。而且crRNA可以通过化学合成大量生产和修饰,这极大地加速了具有可调特异性(即对单核苷酸突变敏感或耐受)的crRNA的筛选和应用。其次,CRISPR/Cas系统不需要变性就可以识别dsDNA。这种独特的结合特性使得CRISPR/Cas系统在不同的光学和电化学检测平台上直接捕获和检测目标基因,以及在活细胞中对基因组位点进行原位成像成为可能。第三,由于dsDNA扩增子易于识别,CRISPR/Cas系统可与其他常用的核酸扩增技术(如PCR、LAMP、RPA)相结合,从而开发超灵敏的核酸检测方法。第四,CRISPR/Cas系统是高度灵活和模块化的,具有不同的核酸酶活性模式。可以通过选择合适的Cas机制来检测不同类别的核酸靶标,包括dsDNA、ssDNA和RNA[19]。

尽管有许多优点,但基于CRISPR的分析和诊断分析的开发和应用也面临着一些挑战。比如,CRISPR/Cas机制存在被生物样品或周围环境中的RNA酶和蛋白酶降解的风险;RNA和蛋白质组分的不稳定性会导致试剂成本增加,所以需要对CRISPR试剂的使用、储存和运输进行规范;还可能因试剂失效而导致检测结果假阴性等。所以对于CRISPR/Cas系统在生物传感中的应用还需要进一步研究,以拓宽其在生物学和现代医学等领域的应用。