UHPLC-MS/MS法测定鸡蛋中11种头孢菌素的残留量

洪丽

(福建省产品质量检验研究院 国家加工食品质量检验检测中心,福建 福州 350002)

头孢菌素是一类含有β内酰胺环的抗生素,具有广谱抗菌特性,毒副作用小,因此在人类和动物的疾病治疗中广泛应用[1]。然而,在动物饲养过程中,滥用头孢菌素会导致药物在动物体内积累,进而产生超级细菌。这些细菌可能通过食物链进入人类体内,对人类健康造成潜在威胁[2-4]。为此,全球各国已制定了动物源性食品中头孢菌素残留的最大限量,其中包括中国、日本、美国和欧盟。在中国最新的兽药残留限量标准(GB 31650—2019)中,规定了头孢氨苄、头孢喹肟和头孢噻呋在动物源性食品中的限量分别为0.2,0.05和1.0 mg/kg。然而,该标准只针对这三种头孢菌素设定了限量,而其他头孢菌素则没有相应的规定。此外,该标准只适用于肉类,未对鸡蛋中的头孢菌素残留限量做出明确规定。然而,中国是鸡蛋生产和消费大国,因此建立一种准确、高效地同时检测鸡蛋中多种头孢菌素的方法具有重要现实意义。

目前,有多种方法可用于头孢菌素的检测。其中,高效液相色谱法[5-13]和毛细管电泳法[14]的灵敏度较低且易受干扰;电化学法[15]和流动注射化学发光法[16-18]的效率较低且重现性较差。相比之下,液相色谱-串联质谱法结合固相萃取技术,具有更高的灵敏度和更强的抗干扰能力,同时前处理方式更为简单,已成为目前食品检测行业中最广泛使用的分析方法。现有的国家标准方法[19-22]针对的主要是肉类、水产品、牛奶蜂蜜等基质,缺少鸡蛋中头孢菌素的测定方法,文献也未见报道。因此,本实验采用超高效液相色谱-串联质谱法,结合固相萃取技术,建立了鸡蛋中11种头孢菌素的测定方法,为今后鸡蛋中头孢菌素的监管提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

头孢氨苄(CAS号:15686-71-2)、头孢拉定(CAS号:38821-53-3)、头孢唑林(CAS号:25953-19-9)、头孢哌酮(CAS号:62893-19-10)、头孢乙腈(CAS号:10206-21-0)、头孢匹林(CAS号:21593-23-7)、头孢洛宁(CAS号:15686-71-2)、头孢喹肟(CAS号:98753-19-6)、头孢噻肟(CAS号:63527-52-6)、去乙酰基头孢匹林(CAS号:38115-21-8)、头孢噻呋(CAS号:80370-57-6)均购自于天津阿尔塔公司,质量浓度均为100 μg/mL的液体单标;所用有机试剂均为色谱纯;水为一级水。

1.2 仪器与设备

液质联用仪:1290液相色谱(安捷伦)-5500(AB SCIEX)串联质谱;称量天平(JY3003,1mg感量,广州市予华仪器有限公司);涡旋器(MixMax,ABSON公司);超声波洗器(HU3120B,恒奥有限公司);离心机(4R Pro,赛默飞公司); UPLC HSS T3色谱柱(2.1 mm×150 mm,1.8 μm,沃特世公司);MAX阴离子固相萃取柱(3 mL/60 mg,沃特世公司)。

1.3 试验部分

1.3.1 色谱条件

色谱柱:UPLC HSS T3(2.1 mm×150 mm,1.8 μm,Waters 公司);流动相A:0.02 mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸),流动相B:甲醇;流速:0.3 mL/min,洗脱程序:0～6.00 min,5%B～90%B;6.00～8.00 min,90%B～90%B;8.00～8.01 min,90%B～5%B;8.01～10.00 min,5%B～5%B。

1.3.2 质谱条件

离子源:电喷雾离子源(ESI+);扫描模式:多反应监测(MRM);离子化电压:5 500 V;Gas1气压:0.345 MPa(50 psi);Gas2气压:0.345 MPa(50 psi);反吹气气压:0.241 MPa(35 psi);离子源温度:600 ℃;质谱参数见表1。

表1 质谱参数

1.3.3 标准中间液及标准系列曲线的配制

准确移取各标准溶液100 μL至10 mL容量瓶,以甲醇稀释得到11种头孢菌素质量浓度均为1.0 μg/mL的标准中间液,再准确分取适量的标准中间液,以10%乙腈溶液稀释成质量浓度分别为0.5,1.0,2.0,5.0,10.0和50.0 ng/mL的标准工作系列,待测。

1.3.4 样品前处理

称取鸡蛋样品2.0 g,加入5 mL 60%乙腈溶液置于超声波中提取30 min后,以5 000 r/min离心并转移上层清液,残渣再加入5 mL 提取液再提取1次,合并两次提取液,经采用3 mL甲醇、3 mL水活化后的MAX柱净化,3 mL水和3 mL甲醇淋洗后,以 5%甲酸甲醇5 mL溶液洗脱,收集洗脱液于30 ℃水浴中氮吹至干,加入1.0 mL的10%乙腈溶液溶解并混匀,过0.22 μm PTFE滤膜后UHPLC/MS/MS测试。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

吸取100 μL混合中间液,以50%乙腈稀释得到200 ng/mL的混合标准溶液,先进行Q1母离子扫描,得到11种头孢化合的母离子[M+H]+,再进行碎片离子扫描Q2获得相应的碎片离子,选取丰度最高产物离子作为定量离子,次高的作为定性离子,最后进行MRM优化每个离子对的去簇电压和碰撞能,优化后的参数见表1。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的优化

对比了常用的BEH C18和HSS T3两种色谱柱对11种头孢类化合物的分离效果。发现强极性化合物去乙酰基头孢在HSS T3色谱柱中具有更强的保留,而在BEH C18几乎不保留,且多数头孢菌素化合物的峰形也更尖锐,分离度也更好,因此采用 HSS T3作为色谱柱。

2.2.2 流动相的优化

分别对比了水(含0.1%甲酸)-甲醇、水(含0.1%甲酸)-乙腈、0.02 mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸)-甲醇、0.02 mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸)-乙腈4种流动相的效果。结果显示,采用甲醇作为有机相时,多数头孢菌素的响应更好;当含有乙酸铵时,头孢菌素化合物的峰更窄且更尖锐,分离度也更好。因此,选择0.02 mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸)-甲醇作为流动相体系,再进行梯度洗脱优化,11种头孢菌素化合物的总流离子图见图1。

1.去乙酰基头孢匹林;2.头孢匹林;3.头孢喹肟;4.头孢氨苄;5.头孢拉定;6.头孢洛宁;7.头孢乙腈;8.头孢噻肟;9.头孢唑林;10.头孢哌酮;11.头孢噻呋。

2.3 前处理条件的优化

2.3.1 提取溶剂的选择

文献报道的提取溶剂主要为乙腈-水溶液。因此,本实验选择阴性鸡蛋样品进行2.0 μg/kg的加标回收实验,对比了50%乙腈水(体积比)～90%乙腈水(体积比)作为提取溶剂的效果。结果发现随着提取液中水相比例增大,头孢菌素的回收率也逐渐提高,当水相比例达到40%时,11种头孢菌素的回收率达到高点,回收率为85.6%～95.8%;而当水相超过40%时,回收率反而有所下降,这是由于当水相高于40%时,乙腈沉淀蛋白的能力降低,所得的提取液也更浑浊,基质效应增强导致回收率下降,最终选择60%乙腈作为提取溶剂。

2.3.2 净化方式的选择

由于鸡蛋样品中含有大量的脂肪、磷脂等杂质,需尽量除去以减少对仪器的污染以及降低基质效应。因此,选用阴性鸡蛋为基质,分别进行2.0 μg/kg的加标回收实验,对比了C18、HLB、MAX三种净化小柱对结果的影响。结果显示采用C18和HLB小柱净化时,7/11(63.6%)化合物的平均回收率在50%以下,这是由于提取溶剂为60%的乙腈,而头孢菌素极性均较强,无法在C18和HLB小柱上保留;而采用MAX小柱时,11种头孢菌素的平均回收率均在80%以上,这是由于头孢菌素类化合物大部分含有羧基,呈弱酸性,而MAX除了具有阴离子交换作用,还具有HLB和C18小柱的反向吸附功能。因此,最终选择MAX小柱作为净化柱。

2.4 方法学评价

2.4.1 线性范围、检出限和定量限

以头孢菌素的峰面积为Y轴,浓度为X轴进行线性回归,发现11种目标物在0.5～50.0 ng/mL质量浓度范围具有较好的线性关系,相关系数R2>0.99。以3倍信噪比对应的浓度为检出限、10倍信噪比对应的浓度为定量限,11种头孢化合物在的检出限为0.2 μg/kg,定量限为0.5 μg/kg(结果见表2),说明该方法具有较高的灵敏度。

表2 11种头孢菌素的线性方程、检出限和定量限

2.4.2 准确度与精密度

在阴性鸡蛋样品中进行1.00,2.00,10.0 μg/kg的加标回收试验,平行实验n=6。从表3可见,11种头孢化合物的平均回收率在81.7%～97.1%,RSD在2.8%～6.8%,说明开发的方法准确度与精密度均较好,说明该方法具有较好的准确度和精密度,可满足分析要求。

表3 准确度与精密度(n = 6)

3 结论

采用UHPLC-MS/MS结合MAX固相萃取技术建立了鸡蛋中11种头孢菌素含量的同步测定方法。在最优条件下进行方法验证,证明了建立的方法简单高效、灵敏度高、准确度和精密度好,适用于鸡蛋中头孢菌素的测定。