洋葱花青素提取工艺优化及其抗氧化活性研究

叶宏宇,刘艺,李芳媛,唐邻凯,韩甜甜,曹宇

(绵阳师范学院 生命科学与技术学院,四川 绵阳 621000)

花青素(Anthocyanidin)是一种具有较强抗氧化潜力的酚类化合物[1],具有清除体内氧自由基、增强新陈代谢能力、抗衰老、预防骨质疏松、增强血管弹性等多种作用[2-3]。近年来,花青素还被证明可应用于食用膜、生物标记、太阳能电池以及可降解材料等领域[4-6]。因为花青素巨大的潜在价值以及广阔的应用前景,其相关问题获得了广泛的关注和研究。研究表明,花青素广泛存在于植物中,尤其是深色的蔬菜和水果中,如葡萄、蓝莓、黑醋栗等[7]。对不同来源花青素的应用价值、成分以及提取方法等进行研究具有实际意义。近年来,已有文献对洋葱中的花青素进行了一定的研究。研究洋葱花青素含量的测定、洋葱中花青素抗氧化活性的测定等[8]。而专门针对花青素的提取工艺优化的研究还有待进一步深入,尤其是有关于紫色洋葱皮中黄酮类花青素的提取方法优化以及抗氧化活性的研究还较为缺乏。基于此,本研究拟选择洋葱中的花青素作为研究对象,利用传统的溶剂提取法对洋葱中花青素进行提取,并且利用单因素和Box-Behnken响应面法对提取方法进行优化。通过方法优化后得到关于洋葱皮中花青素提取的最佳工艺条件,并利用洋葱中花青素对·OH自由基、DPPH自由基和ABTS自由基的清除率的大小比较进行成果验证,为洋葱中花青素的进一步研究、开发与利用提供理论依据和试验数据。

1 实验材料和方法

1.1 材料与试剂

紫皮洋葱(AlliumcepaL.):产地四川。

花青素标准品,纯度≥ 98%,合肥博美生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH),分析纯,合肥博美生物科技有限公司;正丁醇,分析纯,天津市津东天正精细化学试剂厂公司;十二水合硫酸铁铵,化学纯,成都市科隆化学品有限公司;Vc抗坏血酸,分析纯,天津市北联精细化学品开发有限公司;2,2-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(2,2′-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS),分析纯,福州飞净生物科技有限公司;其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-5500紫外-可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司);FA1004B电子天平(苏州江东精密仪器有限公司);HH-6单列恒温水浴锅(常州梅香仪器有限公司)。

1.3 花青素的提取

取洋葱外表皮3.0 g,剪成约1 cm×1 cm碎片,置于50 mL锥形瓶中,加入适量具有一定pH值的乙醇溶液后置于水浴锅中恒温提取,充分提取后以3 000 r/min离心5 min,使提取液与杂质分离,取适量提取液置于试管中,供后续试验。

1.4 含量测定

1.4.1 标准品溶液的制备

精密称定标样25 mg于10 mL容量瓶中,再加入50%乙醇至刻度线,摇匀使标准品充分溶解,得到质量浓度为2.5 mg/mL的花青素标准品溶液。

1.4.2 标准曲线的绘制

花青素的标准曲线见图1。

图1 花青素的标准曲线

使用移液枪精密吸取2.5 mg/mL的标准品溶液0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL分别于5支带刻度试管中,再加入50%乙醇至1 mL。采用铁盐催化比色法显色,实验步骤参考文献[9-10]。随行试剂在相同条件下反应作为空白组,依次测定吸光度值,绘制标准曲线,得到标准曲线为y=1.85x+0.063 8(x为花青素质量浓度,mg/mL;y为吸光度值),R2=0.999 2。

1.4.3 紫洋葱皮提取液中花青素提取率计算

称取洋葱外表皮3.0 g,提取方法见1.3,显色方法同上,用等体积的50%乙醇代替花青素提取液作为空白对照,将测定所得的OD547(Optical Density 547 nm)代入标准曲线,求得质量浓度,代入公式(1)[11]求得相应提取率。

(1)

式中:δ为提取液中花青素的质量浓度,mg/mL;V为提取紫洋葱皮所用50%乙醇体积,mL;N为稀释倍数;m为紫洋葱皮的质量,g。

1.5 单因素试验设计

参考郗艳丽等[11]的研究中对花青素提取时的单因素考查条件,以乙醇为提取溶剂,分别考查乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间和提取pH值五个因素。单因素试验设计因素水平表见表1,基础条件料液比为1∶3,常温提取,提取时间为40 min,pH值未调为乙醇自身pH值。每个条件下重复三次试验,分别考察上述五个因素对洋葱中花青素提取率的影响。

表1 单因素试验设计因素水平及对应提取率结果表

1.6 响应面试验优化

基于上述单因素试验所得到的结果,参照Li等[12]的研究,最终确定以提取率为响应值,选取乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间以及提取液的pH值为因变量,每个因素选取三个水平,进行响应面分析试验。响应面试验设计因素水平表如表2所示。

表2 响应面试验设计因素水平表

1.7 花青素抗氧化试验

1.7.1 提取液对·OH自由基的清除作用

参照张镜等[13]的方法并稍作修改,取优化后得到的花青素粗提取液测吸光度,按照标准曲线计算出质量浓度,稀释得0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mg/L的花青素粗提取液,于5支试管中分别加入1.0 mL,再向试管中加入9 mmol/L硫酸亚铁1.0 mL、9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液1.0 mL和8.8 mmol/L H2O2溶液1.0 mL,最后加蒸馏水至10 mL。充分混匀后37.0 ℃水浴30 min,以同等体积50%乙醇做空白对照,Vc替代花青素提取液做阳性对照,在510 nm处测定样品吸光度。将OD510代入公式(2)计算花青素对·OH自由基的清除率:

(2)

式中:A0为加入随行试剂做空白对照溶液的吸光度;A1为加入提取液反应后的吸光度;Ax1为不加入过氧化氢时本底溶液吸光度。

1.7.2 提取液对DPPH自由基的清除作用

参照邱金东等[14]的方法并结合实际情况,实验对文献方法中的DPPH用量进行了确定。精密称定2.3 mg DPPH试剂,加入无水乙醇溶解后,再用无水乙醇在50 mL棕色容量瓶中定容。同1.7.1法取5个梯度的花青素粗提取液1.0 mL于5支试管中,再向每支试管加入0.08 mol/L的DPPH-乙醇溶液2.0 mL,于30 ℃下避光反应40 min,在517 nm处测定吸光度,Vc替代花青素提取液做阳性试验。代入公式(3)计算DPPH自由基的清除率:

(3)

式中:A1为加入提取液和DPPH溶液反应后的吸光度值;A2为蒸馏水替代DPPH的吸光度值;A3为加入蒸馏水替代提取液的吸光度值。

1.7.3 提取液对ABTS自由基的清除作用

参照丰永红等[15]的方法并稍作修改。精密称定ABTS 38.4 mg和过硫酸钾6.7 mg,分别用蒸馏水定容至10 mL容量瓶后,将ABTS溶液和过硫酸钾溶液1∶1混匀至棕色瓶中放置过夜,得ABTS工作液,于734 nm下测定吸光度,加适量无水乙醇稀释至吸光度为0.7±0.02。另用移液枪按1.7.1法分别取质量浓度为0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mg/L的花青素粗提取液150 μL于5支试管中,加入3.6 mL稀释的ABTS工作液,避光反应6 min后,于547 nm处测定吸光度,以Vc做阳性对照。代入公式(4)计算ABTS自由基的清除率:

(4)

式中:A0为734 nm处ABTS工作液的吸光度;A1为547 nm处3.6 mL ABTS工作液+150 μL花青素提取液的吸光度。

1.8 数据处理与分析

试验数据均采用Origin 2022软件作图对单因素试验数据及抗氧化试验数据进行分析处理,Design-Expert 10.0.1软件进行响应面设计及分析。

2 实验结果与讨论

2.1 单因素试验

单因素试验结果见表1,故确定乙醇浓度50%、料液比1∶6 (g∶mL)、60 ℃、70 min、pH值=2为最佳提取条件。

2.2 响应面试验

根据表2中选取的因素和水平,利用Box-Behnken软件设计了响应面法的实验条件。

通过Design-Expert 10.0.1软件对上述试验设计进行多元回归分析,得到回归方程为:Y=17.75+1.55A+0.70×B+1.29×C+0.72×D-0.86×E-0.82×AB-0.47×AC+0.80×AD+0.097×AE-0.47×BC-0.072×BD-0.28×BE+2.62×CD-0.50×CE+0.042×DE-2.73×A2-3.99×B2-4.60×C2-2.45×D2-2.77×E2。

通过Design-Expert 10.0.1软件分析推出影响本次试验提取率大小的因素为B(料液比)>C(提取温度)>A(乙醇浓度)>E(pH值)>D(提取时间)。二次项CD对响应值极显著(p<0.01),二次项A2、B2、C2、D2和E2对响应值极显著(p<0.01)。

通过Design-Expert 10.0.1软件分析得知:在理想条件下,紫洋葱皮中花青素的提取率最大值为18.26%,此时最佳提取条件为:乙醇浓度52.97%,料液比1∶6.05(g∶mL),提取温度61.35 ℃,提取时间72.70 min,pH值为1.83。考虑到实际操作条件,将提取条件修正成:乙醇浓度为53%,料液比为1∶6(g∶mL),提取温度为61 ℃,提取时间为73 min,pH值为2。

2.3 验证试验

根据上述试验优化修正后得到的最佳条件,进行验证试验,结果为花青素的提取率为18.26%,18.21%,18.30%,花青素的提取率平均值为18.26%±0.04%,相对标准偏差为0.25%。且相较于微波法提取紫色洋葱花青素的1∶10(g∶mL)料液比、女贞子花青素的1∶27(g∶mL)料液比、蓝色金银花浆果的1∶49.42(g∶mL)料液比[8,11,14]等,本实验提取所用提取溶剂含量更少,证明优化可行,具有一定实用价值。

2.4 花青素提取液抗氧化试验

抗氧化结果如表3所示,由表3可知,紫洋葱皮中花青素提取液对·OH自由基的清除效果均高于阳性对照Vc组。与文献中利用葡萄枝蔓提取的花青素的抗氧化测定数据对比[9],此实验在使用比文献中更小的花青素质量浓度下·OH自由基清除率仍高于文献值。对DPPH自由基的清除效果均高于阳性对照Vc组和文献值[9]。对ABTS自由基的清除效果均高于阳性对照Vc组和文献值[8]。

表3 抗氧化结果

3 结论

通过响应面分析法对乙醇提取紫洋葱皮中花青素的工艺进行了优化。试验通过单因素对试验条件进行了初步探索,考察了乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间和pH值这5个因素对紫洋葱皮中花青素提取率的影响。在此基础上,采用了五因素三水平的响应面分析法进行试验条件优化设计,通过优化后得出的紫洋葱皮中花青素提取的最佳提取工艺条件是乙醇浓度53%,料液比1∶6(g∶mL),提取温度为61 ℃,提取时间为73 min,pH值为2。结果的方差分析显示该模型的拟合程度较高。试验条件下,当花青素质量浓度为2.5 mg/L时,对ABTS自由基的清除率达79.66%;当质量浓度1.0 mg/L时,对·OH自由基清除率达70.65%,对DPPH自由基清除率达77.97%。表明紫洋葱花青素提取液具有良好的体外抗氧化活性。实验结果表明紫洋葱中的花青素提取率高,具有较大的抗氧化活性,应用前景广阔。高效提取工艺的研究可以为花青素的工业化生产提供一定的理论依据。今后,洋葱中花青素的大规模工业生产和绿色生产将有望成为研究的热点问题。