microRNA调控角质形成细胞促进皮肤创伤愈合的研究进展

刘唱,罗银利,金哲虎,金升元

皮肤创伤愈合是维持创伤后皮肤完整性所必需的基本生理过程,分为止血期、炎症期、增殖期(肉芽组织形成、血管化、创面闭合)和重塑期(包括瘢痕形成,可持续数周至数年)4个阶段［1-2］,这些阶段驱动不同的细胞类型协同活动,包括角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞和浸润性免疫细胞等［3］。无论是深达皮肤全层的创伤以及浅表的皮肤创伤,再上皮化过程中角质形成细胞都发挥着重要作用,以确保创面闭合,继续下一步愈合过程［4-5］。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一类高度保守的非编码小分子RNA,是基因表达调控的重要分子。近年来,随着对miRNAs在角质形成细胞中的作用有更深的了解,miRNAs已逐渐成为伤口愈合潜在治疗靶点。

1 miRNAs与皮肤创伤愈合

miRNAs是一类非编码小RNA,人类基因中含有众多非编码区,先前认为非编码区是进化上保守的无功能DNA。然而,近年来研究表明,这些DNA转录后可变为有功能的非编码RNA或初始RNA。非编码RNA中最重要的就是miRNAs,对人类1/3左右的基因起着调控作用［6］。miRNAs在细胞的增殖、迁移、分化、发育、炎症等过程中都发挥着重要的调控作用。因此,miRNAs在包括伤口愈合在内的许多病理过程中常可观察到失调,并被认为是许多疾病的治疗靶点［7-8］。早期miRNAs在皮肤领域中的研究主要集中于皮肤肿瘤的发生及皮肤病的治疗,近年来的研究表明,其在皮肤创面愈合过程中也起着重要作用,miRNAs已逐渐成为皮肤领域研究的热点［9］。

研究表明,miRNAs主要参与创伤愈合的炎症、增殖和重塑阶段［10］。其对皮肤创伤愈合重要性的一个主要方面源于它们对表皮角质形成细胞行为的调节［5］,包括miR-21、miR-31、miR-132、miR-19a/b、miR-20a、miR-184、miR-129和miR-335等,探索它们在皮肤创伤愈合中的作用及其调控机制,可为治疗提供新的靶点,具有潜在价值和广阔前景。多种细胞因子和生长因子均可促进角质形成细胞迁移,在众多细胞因子和生长因子中,转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)是角质形成细胞迁移有效的诱导因子之一［11］。一些由TGF-β诱导的miRNAs,如miR-21、miR-31和miR-132等,已经成为关键的miRNA,它们的变化可驱动角质形成细胞的迁移、再上皮化和其他伤口愈合因素。本文将重点介绍那些通过上调表达有望促进伤口愈合的miRNA,例如通过刺激角质形成细胞迁移和其他伤口愈合途径的miRNA。

1.1角质形成细胞与microRNA-21 越来越多的研究表明miR-21在多种肿瘤和心血管系统疾病中显著上调,在肿瘤和心血管疾病的发生发展中发挥着重要作用［12-13］。miR-21在器官损伤中也具有潜在价值,如脑损伤［14］、心肌缺血/再灌注损伤［15］和肝脏损伤［16］等。此外,许多研究也确定了miR-21在皮肤创伤和伤口愈合中的关键作用［17］。在小鼠创面中,miR-21-5p是增殖阶段表达升高的miRNAs之一,敲减miR-21-5p可抑制小鼠皮肤创面再上皮化,而过表达miR-21可促进肉芽组织形成和创面闭合。最近,一种miR-21的模拟物也被证明可以加速伤口闭合［18］。

研究表明,TGF-β可诱导人类永生化角质形成细胞(human immortalized keratinocytes,HaCaT)中miR-21-5p的上调［19］。敲减miR-21-5p可降低细胞依赖TGF-β的迁移,miR-21模拟物可显著促进HaCaT细胞的迁移,miR-21-5p活性的减弱会导致伤口愈合延迟,miR-21的表达升高则可加速伤口愈合。Li等［20］的研究表明,miR-21是通过Smad7-Smad2/3-Elastin信号通路促进伤口愈合进程的。然而,Pastar等［21］的研究却表明,局部应用miR-21-5p模拟物抑制了体外人皮肤器官培养创伤模型的再上皮化,并抑制了大鼠伤口模型中肉芽组织的形成和再上皮化。miR-21-5p在伤口愈合中的转化潜力仍有待进一步研究,对于这种相反的结果,提示在解释使用反义寡核苷酸或反义寡核苷酸的结果时需要谨慎。

1.2角质形成细胞与microRNA-31 研究表明,miR-31在胰腺癌、结直肠癌、口腔鳞状细胞癌中表达上调,在卵巢癌、前列腺癌中表达下调［22-23］。miR-31在人和小鼠皮肤中与再上皮化有关,在创缘皮肤中表达升高,且主要在角质形成细胞中表达［24-25］。TGF-β1、TGF-β2、IL-6可诱导原代人角质形成细胞中miR-31-5p的表达,其中IL-6依赖的miR-31-5p的升高是由转录因子NF-κB介导的,最近在小鼠角质形成细胞和HaCaT细胞中也观察到了类似结果［25-26］。在小鼠皮肤创伤愈合模型中,小鼠表皮miR-31的缺失会抑制角质形成细胞的增殖和伤口闭合,miR-31模拟物则可加速伤口闭合［24,27］。从机制上讲,miR-31是通过调节NF-κB、RAS/MAPK、Notch信号通路和部分细胞因子,正向调节角质形成细胞增殖、分化和细胞活性的［28］。

1.3角质形成细胞与microRNA-132 研究表明,miR-132在心肌梗死后、阿尔茨海默病中表达上调,在乳腺癌、肾癌中表达下调［29-31］。在人类正常皮肤伤口愈合炎症阶段表达也上调,其特点是能够减轻炎症,同时在伤口愈合过程中刺激角质形成细胞的增殖和再上皮化［32-33］。在外科腹部伤口中,miR-132-3p是人体皮肤动态调节的miRNA［32］。在多种刺激中,只有TGF-β1和TFG-β2在原代角质形成细胞中诱导miR-132-3p的表达。对pre-miR-132负载角质形成细胞的转录组分析和基因本体论(gene ontology,GO)分析发现下调的免疫反应基因高度富集,在pre-miR-132转染细胞中表达上调的基因在与细胞周期相关的过程中被富集［32］。Pre-miR-132可通过增加表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)及其下游靶基因STAT3和ERK的激活来促进角质形成细胞的增殖。

miR-132的抗炎和增殖作用可归因于miR-132-3p抑制肝素结合性表皮生长因子(heparin binding epidermal growth factor, HB-EGF)。结合对miR-132表达调控后HB-EGF水平的分析,均证实了miR-132对HB-EGF的调节作用［32］。此外,用siRNA沉默HB-EGF可以复制pre-miR-132对角质形成细胞的影响,包括抑制NF-κB和增强EGFR信号通路。

总之,miR-132的缺失延迟了小鼠皮肤伤口愈合,miR-132-3p模拟物可加速糖尿病小鼠的伤口愈合［32-33］。与此一致,在人类体外皮肤创伤中,抑制miR-132可减慢再上皮化,而miR-132-3p模拟物则可加速再上皮化［32-33］。由于miR-132在糖尿病足溃疡中的表达低于普通皮肤伤口,这些研究发现共同表明miR-132的上调在创伤愈合治疗中具有巨大潜力。

1.4角质形成细胞与microRNA-19a/b和micro RNA-20a 研究表明,miR-19a/b和miR-20a在食管癌、胃癌、乳腺癌中表达上调［34-35］。最近,Li等［36］还发现其在创伤愈合过程中可以抑制炎症。由miR-17～92簇编码的6个miRNAs(miR-17、miR-18a、miR-19a和miR-19b、miR-20a、miR-92)在慢性创伤中与受伤的普通皮肤相比较低,其中miR-19a、miR-19b和miR-20a在表皮中的表达明显下调。尤其是在糖尿病小鼠中,角质形成细胞特异性miR-17～92条件性基因敲除小鼠的伤口愈合被延迟,使用特异性条件性敲入(conditional knock-in,cKI)miR-17～92簇或单独的miR-19b则可加速糖尿病小鼠的伤口愈合［36］。

从机制上讲,miR-19a/b和miR-20a是通过降低Toll样受体(TLR3)介导的NF-κB信号通路从而抑制角质形成细胞的炎症反应。因此,作为创面炎症的重要调节因子,miR-19a/b和miR-20a的缺失可能会导致慢性创面的持续炎症和愈合障碍。与此一致,miR-19b和miR-20a联合治疗可以改善2型糖尿病小鼠模型的伤口愈合［36］。Zhang等［37］的研究也表明,miR-17～92簇促进角质形成细胞的增殖和细胞周期进展是通过miR-17、miR-18a、miR-19a和miR-19b的协同活性来实现的。

1.5角质形成细胞与microRNA-184 研究表明,miR-184在骨肉瘤和肾癌中表达上调,在子宫内膜癌、烧伤组织中表达下调［38-41］。当miR-31和miR-132促进角质形成细胞迁移和增殖时,miR-184具有促进角质形成细胞迁移和分化的能力［42-44］。细胞外Ca2+的升高是角质形成细胞分化的主要诱导剂,在细胞中可诱导miR-184的表达［42,44］。此外,miR-184的上调与角质形成细胞增殖的减少和角质形成细胞分化的增强有关,这与细胞周期蛋白E:DNA的损伤和NOTCH信号通路也有关［42,44］。鉴于通过基底层以上的迁移是表皮分化所固有的,Richardson等［43-44］又研究了miR-184对角质形成细胞迁移的影响,研究表明角质形成细胞单层划痕损伤可诱导miR-184的表达增加50倍,这提示miR-184可能在再上皮化的后期阶段发挥关键作用。外源性的miR-184可促进角质形成细胞迁移增加约3倍,而miR-184抑制剂则可抑制角质形成细胞的迁移减慢约3倍。

然而,还需要进一步的研究来确定miR-184是否可以通过其对角质形成细胞分化和迁移的影响来促进正常人和糖尿病伤口的愈合。鉴于终末分化是表皮角质形成细胞的最终命运,miR-184在迁移过程中激活分化途径的能力可能是其转化潜力的基础。

1.6角质形成细胞与microRNA-129和microRNA-335 研究表明,miR-129和miR-335在乳腺癌、胃癌中表达下调,在糖尿病大鼠创面中表达也下调［45-47］。糖尿病创面是一个高度蛋白水解的环境,其基质金属蛋白酶(MMPs)的持续升高会导致细胞外基质降解、炎症调节失衡和伤口闭合受损［48］。越来越多的研究表明,MMP-9是难愈合伤口病理的主要驱动因素［49-50］,特异性蛋白1(specificity protein ,Sp1)可调节HaCaT细胞中MMP-9的表达,暴露在糖化白蛋白中以重现糖尿病伤口中富含晚期糖基化终产物(AGE)的微环境可增加HaCaT和原代角质形成细胞中Sp1和MMP-9的表达［51］。

Wang等［51］的研究表明,糖尿病患者血清中共有58个miRNAs表达下调,其中miR-129-5p和miR-335-5p是Sp1的预测调控因子,荧光素酶报告实验和蛋白免疫印迹分析均证实了这一点。更重要的是,miR-129-5p和miR-335-5p在糖化血清白蛋白处理的HaCaT细胞中表达也降低,这建立了miR-129-5p和miR-335-5p的缺失及其靶点Sp1的上调之间的联系。同时,HaCaT细胞中Sp1和MMP-9的年龄依赖性升高可以被miR-129-5p和miR-335-5p模拟物完全逆转。与此一致,反复给糖尿病大鼠伤口皮内注射miR-129-5p和miR-335-5p模拟物加速了伤口愈合。从机制上讲,miR-129-5p和miR-335-5p是通过抑制Sp1介导的MMP-9表达促进糖尿病创面愈合的［51］。

2 总结与展望

通过给予特定的miRNA模拟物或抑制剂来调节miRNA的表达对多种疾病均有良好的效果,例如肿瘤和心血管疾病等。越来越多的研究表明,miRNAs是皮肤创伤愈合的重要调节因子,其可通过对表皮角质形成细胞行为的调控促进皮肤创伤愈合,这提示miRNAs是皮肤创伤愈合的潜在治疗靶点。通过文献总结我们还发现了一种组合方法,其中两个或更多的miRNA模拟物靶向不同但互补的创伤愈合过程,可能比任何单一的miRNA模拟物更能有效的促进创伤愈合。重要的是,调控miRNAs可能比针对单个蛋白质为靶点的传统药物更有效,因为miRNAs往往通过靶向网络中的几个关键基因来调控整个信号网络。然而目前皮肤创伤愈合中精确的miRNAs调控网络仍未建立,如何利用 miRNAs调节皮肤创伤愈合以及瘢痕修复,仍是一个亟待解决的问题。因此,明确miRNAs在皮肤创伤愈合中的治疗潜力和分子机制是非常有意义的,这将有助于开发更有效的创伤愈合治疗方法。随着研究者对miRNAs在创伤愈合作用中的深入研究,有望为创伤愈合的治疗提供新的视野和更大的临床价值。