中医药治疗青春期功能失调性子宫出血的用药规律及新筛选方作用机制的网络药理学研究*

白 茸，姜 玥，韩延华，吴效科，张跃辉

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040）

功能失调性子宫出血（dysfunctional uterine bleeding，DUB）指月经周期、经期出现异常，多表现为月经的淋漓不尽或量大如潮[1]。DUB是无潜在结构异常情况下的异常子宫出血，占青春期异常子宫出血的95%[2]。本病属中医学中“崩漏”范畴，以“肾-天癸-冲任-胞宫”轴失调为基本病机，具有迁延难愈、易反复发作的特点。DUB为导致青春期女性住院的高发妇科疑难疾病，严重影响青春期女性正常学习和生活，容易给青少年造成极大的心理压力。青春期DUB的治疗方案多取决于出血的严重程度。此外，积极预防并发症以及调整并重塑月经周期也是治疗本病的基本原则。

中医药从辨证论治、审病求因的角度出发，在治疗青春期DUB方面具有独特优势。尽管之前有学者分析总结DUB的用药规律，但并未阐述其可挖掘的新组方。笔者收集中文文献数据库中中医药治疗青春期DUB的医案，借助中医传承辅助平台，在分析其用药规律和预测新方的基础上，运用网络药理学和分子对接对其新方潜在作用机制进行研究，以期指导临床。

1 资料与方法

1.1 数据来源 借助中国知网、万方和维普数据库，以“青春期”AND（“崩漏”OR“功血”OR“异常子宫出血”OR“功能失调性子宫出血”OR“排卵障碍性异常子宫出血”）AND（“中医”OR“中药”）为检索词，交叉检索自建库至2021年9月的相关文献。

1.2 纳入标准 （1）研究类型：实验性研究、观察性研究等治疗组患者≥20例且有明确处方的文献；（2）研究对象：临床明确诊断为异常子宫出血或DUB患者，年龄9～20岁且无性生活史；（3）干预措施：治疗组含有口服中药汤剂；（4）随证加减的纳入其基础方。

1.3 排除标准 （1）动物实验类文献、会议文件、综述类文献、重复文献等；（2）处方不完整或含周期用药的文献；（3）中医外治法等其他方式治疗的文献；（4）口服中成药的文献。

1.4 数据处理 将收集到中药的名称、功效及性味归经参考2020年版《中华人民共和国药典》[3]、《中华本草》[4]及《中药学》[5]进行规范化处理。如炒地榆、地榆炭统一为地榆，炮制方法不同、功效有差异的分别记录，如分别记录荆芥穗、荆芥、荆芥穗炭。

1.5 青春期DUB用药规律分析 利用中医传承辅助平台对文献所涉及中药进行性味归经、药物频数统计、关联规则和潜在新方分析。

1.6 网络药理学机制探究 通过“1.5”用药分析得到潜在新方，借助中医药数据库及分析平台（Traditional Chinese Medicine Database and Analysis Platform, TCMSP）[6]对新方2的中药化学成分进行检索，以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（Drug likeness，DL）≥0.18进行筛选[7-8]，并进行各成分靶点的收集，借助Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）[9]完成靶点与基因名的匹配。同时在Gene-Cards[10]、在线人类孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM）数据库中输入关键词“Dysfunctional uterine bleeding in adolescence”，收集疾病的相关靶标，将药物的靶点与疾病的靶点进行映射，得到新方2治疗青春期DUB的关键靶点。利用Cytoscape3.9.0构建“青春期DUB-药物-化合物-靶点”网络，采用STRING平台、David数据库对潜在作用靶点进行蛋白相互作用（PPI）网络及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）通路富集分析[11]。通过PubChem、Uniport、蛋白质晶体结构数据库（Protein Data Bank，PDB）获取化合物和靶点的2D结构式，运用AutoDockVina程序对重要化合物和靶点进行分子对接，计算结合能大小，并利用PyMol软件将结果可视化。

2 结 果

2.1 文献纳入情况 检索得到文献3 830篇，筛选删除重复文献后得到1 281篇文献，根据纳入标准、排除标准进一步阅读后，最终共筛选出文献140篇，涉及154个中药复方，整理后录入于中医传承辅助平台（V2.5），建立数据库。

2.2 高频药物分析 本研究最终纳入154个中药复方，涉及143味中药，根据频数从高到低排序，前5味中药分别为白术、熟地黄、黄芪、山茱萸、阿胶。高频中药使用频数及频率见表1。

表1 高频中药频数及频率

2.3 性味归经分析 143味中药的药性以温[38.03%（618/1625）]、平[28.68%（466/1 625）]、寒[27.57%（448/1 625）]为主，药味以甘[40.44%（1 081/2 673）]、苦[23.91%（639/2 673）]、辛[12.00%（321/2 673）]为主，归经以肝经[29.27%（1148/3 922）]、肾经[23.33%（915/3 922）]、脾经[14.99%（588/3 922）]为主。（见图1）

图1 中药四气、五味、归经雷达图

2.4 基于关联规则的方剂组方规律分析 对筛选出来的方剂进行组方规律分析，在中医传承辅助平台数据分析版块的组方规律中设置“支持度”为31[12]，“置信度”为0.8，得到21组高频药物模式，共包含12味中药。（见表2）

表2 基于关联规则的高频药对

2.5 新方分析 运用中医传承辅助平台中数据分析版块的新方分析功能，在相关度设置为系统随机默认值5，惩罚度2的聚类基础上，得到4个新方组合。（见表3）

表3 新方组合

2.6 网络药理学机制探究 对新方2（党参+升麻+黄芪+女贞子+墨旱莲）的成分和靶点进行筛选，得到靶点共1 276个，在GeneCards和OMIM数据库中检索青春期DUB的靶点，合并去重后得到青春期DUB靶点1 810个，将中药靶点合并去重后与其映射得到中药治疗青春期DUB的关键靶点141个。运用String平台对关键靶点进行PPI网络分析，将结果导出保存，进一步运用Cytoscape将结果可视化优化处理。（见图2）按照节点度值从高到底排序，前5的关键节点为AKT1、p53肿瘤蛋白（TP53）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、VEGFA，表明这些基因在新方2治疗青春期DUB中具有重要作用。

图2 新方2 药物治疗青春期DUB 的PPI 网络

应用Cytoscape3.9.0软件构建“青春期DUB-药物-化合物-靶点”网络，共包括196个节点，其中靶点占141个，疾病占1个，活性成分占49个，药物占5个；经统计共有1 029条边。（见图3）其中MOL000098（quercetin、槲皮素）、MOL000006（luteolin、木犀草素）、MOL000422（kaempferol、山奈酚）为度值（degree）排名靠前的成分，在治疗青春期DUB中有着重要作用。

图3 青春期DUB-药物-化合物-靶点网络图

对141个关键靶点通过David数据库，进行KEGG通路分析，并通过阅读文献去除与青春期DUB关联度小的疾病信号通路（如糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等），最终可视化关联度较高的前20条信号通路。（见图4）通路富集于癌症通路、PI3K/AKT信号通路、NF-κB信号通路等，其中NF-κB通路是最经典的与炎症反应相关通路。

图4 KEGG 通路分析

对阅读文献及分析结果得到的新方2治疗青春期DUB的重要化合物槲皮素、木犀草素、山奈酚与潜在作用靶点AKT1、VEGFA、TNF、IL-6进行分子对接，对接结果得分均≤-5.0kcal/mol，初步推断新方2与靶点有较好的结合活性，具体对接值见表4。对接结合力值越低表明配体和受体结合越稳定，越可能发生相互作用。VEGFA与槲皮素、木犀草素和山奈酚的结合力均较低，木犀草素与VEGFA的结合力值最低，为-7.4 kcal/mol（1 kcal≈4.186 kJ），表明其亲和力强，对接可视化模型见图5。

3 讨 论

青春期DUB与青少年下丘脑-垂体-卵巢轴不成熟、机体性激素水平紊乱有关。青少年的异常子宫出血常被诊断为多囊卵巢综合征（PCOS）[13]，同时DUB还是青春期PCOS的早期征兆[14]。DUB的危险因素除肥胖外，还可能与环境、精神情绪、内分泌等因素有关。西医对于DUB的治疗选择包括口服避孕药、孕激素、非甾体抗炎药、氨甲环酸、GnRH类似物、达那唑和左炔诺孕酮释放子宫内系统等，现多采用激素序贯疗法[15]。临床显示，这些治疗方法虽具有迅速止血的效果，但不良反应较大，病情易反复。中医学认为本病的主要病机为脏腑失调，冲任损伤，不能制约经血[16]。其致病因素不外乎虚、热、瘀，且青春期为肾气尚未充盛之时，此期的女性体质多虚，易出现脏腑虚证。

本研究共纳入中医药治疗青春期DUB的方剂154个，涉及143味中药，四气以温为主，五味以甘、苦为主。甘能缓急，而肝为木脏，主升发。甘温可缓肝之急，温肾阳健脾祛湿；苦能坚阴、燥湿，苦温祛脾之寒湿。归经以肝经为主。《临证指南医案》曰：“女子以肝为先天”[17]。可见肝在青春期DUB发病与治疗中具有重要作用。中药归经其次为肾经、脾经等，印证了本病与肝、肾、脾等脏腑密切相关。其四气、五味、归经与脏腑疾病之间有较强的相关性，也证实本研究数据的准确性。

用药频数统计显示，出现频数较高的药物有白术、熟地黄、黄芪、山茱萸等。根据支持度和置信度进行关联规则分析，得出的主要药对有黄芪-白术、女贞子-墨旱莲、熟地黄-山茱萸等，以上药物突出的功效主要有健脾益气、滋阴补血、补气升阳、补益肝肾、凉血止血等。《长沙药解》言白术“最益脾精，大养胃气”。《本草蒙筌》亦记载：“在气主气，在血主血。”故白术善助脾运以益气摄血，且具有调节脾胃功能、抑制宫缩、增强机体免疫、调节生殖系统的作用[18-19]。白术与黄芪配伍为用，令脾气旺而统摄有权。熟地黄，味甘，归肝、肾经。熟地黄配山茱萸，滋补肝肾阴虚之效更佳。研究[20-23]证明熟地黄能止血、促进造血功能，且具有雌激素样作用。女贞子、墨旱莲为二至丸的组方药物，一者甘苦，一者甘酸，相须配伍，可增强滋补肝肾的作用。党参配白术、黄芪，益气健脾养血。

本研究得到4个新方组合。新方1中茜草、地骨皮凉血止血，龙骨、牡蛎、海螵蛸收敛止血。新方1补敛兼顾，标本兼治，适合气虚出血。新方2中黄芪、党参、升麻健脾益气；女贞子、墨旱莲补肾滋阴，养血止血。新方2适合气阴两虚出血。新方3、新方4分别适合血瘀出血和肾虚出血。4个新方组合为二至丸、龙骨牡蛎汤、固崩止漏汤等重要组成成分。新方2中党参性平味甘，治虚劳内伤、妇女血崩、胎产诸病”；升麻有升提下陷之中气的作用；女贞子、墨旱莲具有促凝止血[24]、免疫调节[25]、雌激素样作用[26]。全方可理解为二至丸合补中益气汤加减，尤其适用于肝肾阴虚伴脾虚肥胖型的异常子宫出血。

网络药理学结果显示新方2治疗青春期DUB的重要成分为槲皮素、木犀草素、山奈酚、豆甾醇等；新方2起效的关键蛋白主要是AKT1、TNF、IL6、VEGFA等。慢性子宫内膜炎症可引发异常子宫出血[27]，而月经出血也可引发慢性子宫内膜炎。REAVEY J J等[28]研究表明，肥胖导致月经时局部子宫内膜炎症状态加重，炎症介质TNF、IL6显著增加，会延迟子宫内膜修复，增加失血量。异常子宫出血还可能与子宫内膜血管生成紊乱、子宫内膜微血管脆性增加及子宫内膜缺氧有关。槲皮素是一种重要的类黄酮，在卵巢发育中起雌激素样作用。槲皮素可增加健康卵泡的体积和数量，减少闭锁卵泡的数量[29]，调节卵巢功能，抑制子宫内膜增生、血小板聚集等，从而在“卵巢-子宫”的反馈下发挥止血的作用。木犀草素可通过抑制凝血酶原时间和激活部分凝血酶时间表现出止血活性。此外，木犀草素作为天然抗氧化剂，具备良好的自由基清除和细胞保护特性，可通过抑制核因子-κB的磷酸化，调节信号传导及转录激活蛋白3（Signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）和激活蛋白1（Activator protein-1,AP-1）发挥抗炎作用[30]。VEGF是影响血管新生及内皮屏障保护的重要因子。雌激素也是内皮功能的重要调节因子，在子宫内膜中具有促血管生成和抗血管生成的双重作用，可刺激内皮细胞VEGFA上调，降低周细胞对血小板衍生生长因子β（platelet derived growth factor, PDGF-β）招募活性的敏感度，消融新生血管芽的周细胞覆盖，导致微血管不稳定，增加微血管壁的脆性，从而可能导致出血。AKT能在子宫内膜癌中调节孕激素受体B依赖的转录和血管生成。VEGF高表达可促进新生血管的生成，过度增厚子宫内膜进而引发内膜剥脱的突破性出血。GAO F等[31]研究证实AKT1在体内具有血管保护作用，被VEGF激活后可长期保护内皮屏障，促进子宫内膜的修复，从而起到止血的作用。山奈酚能显著抑制炎症，通过降低脂多糖（lipopol ysaccharide，LPS）诱导的TNF-α、IL-6、细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管细胞黏附因子-1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）过量生成，进而影响相关炎症介质的释放[32]。ICAM-1作为淋巴细胞功能相关分子1（lymphocyte Function-associated antigen1, LFA-1）的关键配体，在子宫内膜广泛分布，可促进多种病理状态下的白细胞招募。该分子在子宫内膜中具有重要的生理作用，可影响正常月经来潮[33]。二至丸治疗肝肾阴虚型崩漏可能与AKT1、IL-6、TNF、TP53减少炎症细胞的分泌，降低炎症反应有关[24]。

分子对接显示新方2的活性成分与靶点具有较好的结合能力，结合能均小于-5.0 kcal/mol。其中木犀草素与VEGFA的结合效果最佳。木犀草素、槲皮素能显著抑制VEGF的表达，从而影响血管新生[34-35]。

KEGG通路富集结果显示，相关靶点主要富集在PI3K/AKT信号通路、NF-κB信号通路、癌症通路等通路；子宫内膜癌是女性生殖道最常见的恶性肿瘤之一，生殖器异常出血是子宫内膜癌最重要的症状。尽管大约80%的子宫内膜癌发生在绝经期或绝经后妇女，但发生在青少年的异常子宫出血不容小觑。有研究表明补肾中药可通过PI3K/AKT/NF-κB信号通路，减少卵巢颗粒细胞凋亡，增加卵巢血流供应，进而提高卵巢功能[36]。尽管网络药理学对相关靶点进行了KEGG通路富集分析，但通路与DUB之间的研究较少，这或许可以为日后DUB通路的机制研究提供思路。

综上所述，中医多从肝肾论治青春期DUB，用药性味以甘、温为主，多入肝、肾、脾经。挖掘出的新方2药物中主要活性成分为槲皮素和木犀草素，其主要通过AKT1、VEGFA等关键靶点及PI3K/AKT等信号通路来干预青春期DUB的进展，药物起效可能与止血、抗炎及子宫内膜修复等机制相关，但仍有待于进一步实验验证及临床实践的探讨。