双水相萃取技术在生物制药中的应用

张 璟，邢 娜，韩 杨

（1.齐鲁医药学院，山东 淄博 255300；2.淄博市食品药品检验研究院，山东 淄博 255086）

0 引言

分离提纯技术现已被广泛应用于基因工程、蛋白质工程等高新生物技术当中，但这些高新生物技术对生化分离技术的要求也更为苛刻，尤其是操作步骤更为繁琐、处理时间也更长，严重影响到生物技术的工业化发展进程。分析双水相萃取技术的特征，就其温和高效的分离提纯过程，以及提纯过程不会使物质失活破坏的特点，通过不断完善该项技术的集成工艺，双水相萃取技术的生物领域应用将更为广泛。

1 双水相萃取技术作用机理

1.1 作用机理

与水-有机萃取技术类似，双水相萃取技术是利用待萃取物质在两相间的选择性适配，由于两相性质不同，萃取物质进入两相介质的表面性质、化学键的不同，也就导致两相中赋存萃取物质的浓度发生了变化。通过分析萃取物质在两相中的浓度比也就是分配系数值K，实现物质分离提纯过程。双水相萃取技术早在1995 年就进行了生物工程方面的应用，研究者通过双水相技术研究聚乙二醇、葡聚糖的萃取分离过程，也研究了聚乙二醇与盐系统的提纯分离过程；经过近二十年的发展，双水相萃取技术已形成两类基本模型：一是利用热力学作用原理发展出的晶格模型，通过聚合成相作用研究蛋白质等物质的分离提纯；二是渗透维里模型，通过粒子能量功能，研究包括逆流层析、双水相亲和分离等方面的应用。

1.2 双水相萃取分离特点

双水相萃取技术通过利用两相溶液的聚合，当两相水溶液浓度含量过高时自然分离效果，实现有用物质的分离提纯。该项技术最早发现于18 世纪90 年代在研究人员研究明胶、可溶淀粉两种水溶液混合过程，通过将上述两种溶液混合，得出一个浑浊不透明液体，随后静置发生分离，形成两层液相溶液，也就是双水相溶液。从双水相溶液形成的特点来看，该体系形成的主要原因是利用了高聚物之间的不相容效果，也就是高浓度水相体系的阻碍作用，导致两水相无法互相渗透，从而实现了两相分离，因此两水相体系需要一定的形成条件，包括温度、溶质等，一般具备如下分离特点：

1）适应条件温和。双相水萃取技术两相体系中大部分成分是水，因此在溶质混合过程中不会因有机溶剂的使用，对所需分离提纯溶质产生破坏，甚至能起到一定的保护效果，也就更适用于生物活性物质的提纯过程。

2）操作简便。由于是两水相的分离提取过程，两相张力小，可直接于后续分离工序衔接，无需经过额外蒸馏处理等操作，常温操作过程适用工具简单，生物活性物质不会失活。

3）萃取量大，效率高。双水相萃取技术回收率可达90%左右，同时两相分离速率也很快，体系选取合适情况下，分离提纯倍数可达到20 倍，回收率十分可观。

基于以上分离特点，双水相萃取技术的作用机理主要是两相溶质憎水程度存在不同时，就会分离出两水相体系，出现相分离效果，同时憎水性差异越大，分离速率越快或分离越容易。通过分析一般性有机萃取方法与双水相萃取技术进行对比，可以很容易看出双水相体系中两相密度以及折射率通常较小，这也就导致两相水溶液的张力较小，一般有机萃取体系中水溶液界面张力可达1×10-3～2×10-2N/m，而对于双水相萃取体系的界面张力通常只有10-6～10-4N/m。也就是说主要是溶质与水溶液可以形成亲水聚合物，在于另一种亲水性聚合物相混合时，就可自然分离成两水相体系，如表1 所示。这也就导致了双水相体系常温操作简便、条件温和的特点。

表1 几种常见的双水相聚合物体系

2 双水相萃取技术在生物制药中的应用

基于双水相萃取技术的使用优势，在生物制药方面，尤其是在蛋白质、酶、细胞膜、核酸以及天然组分等分离提纯方面，该项萃取技术都有着广泛的应用。

2.1 双水相萃取技术在提纯分离蛋白质中的应用

该项萃取技术最早的应用手段就是用于蛋白质、酶组分的纯化，在上世纪60 年代的研究中，人们就发现利用双水相系统分离生物大分子，可以得出蛋白质、酶、核酸、抗原抗体以及细胞的分配数据。由于传统萃取技术分离出的蛋白质、酶都会变性失活，双水相萃取技术在生物应用之初就表现出极大的优势。

例如利用PEG4000/磷酸盐萃取液从细胞破碎液中分离青霉素酰化酶，萃取率可以达到90%以上，纯度也很高，将该方案进行工业化制取青霉素酸化酶应用将带来极大便利；利用PEG/（NH4）2SO4双水相体系从发酵液中萃取α 蛋白酶、淀粉酶等，萃取回收率可达60%，活性比原发酵液高出1.5 倍，效果显著；利用双水相萃取技术常温从枯草芽孢杆菌发酵液中分离β-甘露聚糖酶，相比原发酵液纯度可达2.76 倍，同时萃取回收率也接近99%。

同样利用双水相萃取技术分离提纯蛋白质过程中，通过研究牛血清蛋白在聚乙二醇或硫酸盐形成的两水相水溶液中的分层特点发现，牛血清蛋白主要形成在双水相体系的下层，同时通过改变硫酸盐含量即双水相体系的酸碱度，并不会对两水相溶液的分配比产生影响；然而在双水相体系中添加氯化钠却会显著改变牛血清蛋白在体系中的分配情况，在双水相体系中未添加氯化钠离子时，牛血清蛋白主要形成在双水相体系中的下层，而随着氯化钠离子的加入，牛血清蛋白在双水相体系中会占据上层、甚至存在于双水相体系的上表层。

2.2 双水相萃取技术在分离抗生素中的应用

在20 世纪90 年代人们利用双水相系统分离生物小分子时，包括抗生素、氨基酸以及天然药物提纯过程中，发现双水相萃取技术在能耗上要明显低于传统萃取技术，同时在提取效率上也有着显著优势。例如利用PEG3350/K2HPO4溶液萃取青霉素G 发酵液，青霉素G 的分配系数可达13～14.5，萃取率高达97%，提纯纯青霉素溶液时，萃取率也能达到95%；在利用双水相萃取技术分离提纯抗生素时，影响抗生素提纯分离的因素主要是疏水作用力，例如在现阶段研究中发现了红霉素纯品、乙酰螺旋霉素纯品在双水相系统中的萃取分配行为，可以清除的看出聚合物平均分子量、pH 值等因素对提纯物分配系数的影响。

同理，利用双水相萃取技术从发酵液中分离提取丙酰螺旋霉素，双水相体系可选用PEG 以及磷酸氢钠溶液，萃取酸碱度及磷酸氢钠含量通常控制在pH=8.5 左右，PEG 水相质量分数14%，磷酸氢钠溶液含量18%，通常丙酰螺旋霉素的提纯效率可达69.2%。利用该体系完成丙酰螺旋霉素的提纯作用，提纯效率主要受PEG 相对分子量的影响，通常选用相对分子质量较小的PEG 可以减缓高聚物分子的相互排斥，通过降低水相体系之间的黏度，促进丙酰螺旋霉素的分离提纯效果，从而提高抗生素分离效率。

2.3 双水相萃取技术在提纯天然组分中的应用

天然组分在生物制药中的应用占据很大比重，利用双水相萃取技术分离提纯天然产物组分，可以有效保护所需组分的活性。例如研究葛根素在PEG/（NH4）2SO4双水相体系以及丙酮/K2HPO4溶液中的分离特征，在前者体系中PEG1500 质量分数达到20%，（NH4）2SO4质量分数达到16%，所得组分的分配系数高达148.2，同时萃取回收率高达99%以上；而在后者丙酮萃取溶液中，丙酮与水的质量配比为8∶2，K2HPO4质量1.5 g，最终所得萃取回收率达到了99.55%，因此可以看出双水相萃取技术在提纯天然组分中的应用效果较好[1]。

2.4 其他双水相萃取体系的应用

1）电泳分离氨基酸小分子。随着双水相萃取技术的普及应用，研究人员进行了利用双水相技术电泳分离氨基酸小分子方面的研究，通过分析双水相及自由流动电泳对核内体的分离现象，发现仅需配置自由流动性电泳，就可实现核内体的溶解分离，无需仅需两相分离实现小分子氨基酸的提纯效果。在现阶段的应用中，实现了聚乙二醇、葡聚糖、氨基酸小分子的电泳分离研究，通过分析水相浓度、萃取效率以及总传质量，得出了利用双水相技术电泳分离氨基酸的一些规律。

2）双水相技术表面活性剂方面的应用。通过利用季铵盐型阳离子表面活性剂以及阴离子表面活性剂两种体系按一定浓度混合，形成一种新型双水相体系，由于季铵盐型阳离子的头基比较大，可以形成一种分离检测溶液，实现一些低浓度、痕量成分的检测效果，该检测溶液具有操作简单、检测速率快等特点。同时由于该新型双水相溶液仅含低浓度的表面活性剂，因此不会造成生物活性物质的变形失活，可以广泛应用于该方面的分离提纯过程。

3 双水相萃取技术的研究

分离提纯技术的高低直接影响到生物制药工业化发展进程，数据表明生物制品的接近90%都依赖萃取分离过程，因此研发效率更高，技术可靠的分离提纯技术是保障生物制药工业化高效快速发展的前提条件。

3.1 新型双水相萃取体系的研发

双水相萃取体系在生物制药中的应用包括聚合物/聚合物/水、聚合物/无机盐/水两种，前一种体系使用成本较高，不利于工业化生产应用；后者则由于无机盐废弃液的存在，不进行废水处理会对生态环境造成严重破坏，也影响到工业化生产应用。也就是说，新型双水相萃取体系的未来研发方向，主要集中在廉价型双水相体系的研发工作中，通过应用一些成本低廉的高聚物，来代替现有成本高昂的高聚物。例如利用羟基纤维素代替PEG，或利用乙烯基氧与丙烯基氧相混合形成的聚合物，与PEG 组成的温敏性双水相溶液，通过低成本高聚物或对高聚物进行有效低成本回收，降低双水相萃取技术的工业化应用成本。因此研发绿色清洁的双水相萃取体系，也是确保该项萃取技术迈向工业化生产阶段的前提保障。

现阶段的研究发现，利用廉价的变性淀粉、糊精、麦芽糖等产品替代葡萄糖，利用廉价的聚乙烯醇、羟基纤维素等替代PEG，所得的双水相体系进行生物制药的工业化萃取，成本相对较低，有着工业化应用前景；同时利用离子液体双水相体系，与传统双水相体系萃取相比，利用离子液体、双水相萃取系统相结合的方式，萃取粘度更低、分离提纯时间更短，同时离子液体可以回收再利用，也是未来双水相萃取技术的发展方向[2]。

3.2 双水相萃取技术的集成化与耦合

该项萃取技术虽然在生物分离萃取领域应用广泛，但仍然存在着一些问题，包括萃取过程中的乳化现象、分离提纯耗时长、成相聚合物成本昂贵等问题，也是限制该萃取技术工业化应用的显著缺陷。因此，通过将该项技术与其它技术进行集成耦合，就可充分发挥出集成系统的各项优势，对萃取技术存在的缺陷进行弥补，集成系统的优势包括：

1）萃取技术与磁场、超声波以及气溶胶技术集成耦合，可以有效提高萃取分离速率，同时也可避免有机溶质的乳化问题，有助于萃取技术的工业化生产应用；

2）萃取技术与亲和沉淀、层析等生化分离技术集成耦合，可以使萃取分离技术更为简洁高效。通过与生物转化、化学渗透以及电泳等技术集成，可以有效解决萃取技术无法工业化批量生产难题，为细胞、酶的回收利用提供借鉴。

3.3 成相聚合物循环利用

基于成相聚合物成本昂贵的问题，在工业化应用方面确保成相聚合物的循环使用，是降低生产成本，批量化规模化发展双水相萃取技术的关键。在现阶段的研究中发现，在成相聚合物PEG 中加盐生产新的萃取体系，可以使酶向富盐相偏移，从而实现聚合物循环利用目的[3]。例如通过上述氯化钠溶液在牛血清蛋白中的配比，将原有牛血清蛋白从双水相体系中的下层，随着氯化钠含量的提高迁移至双水相体系中的上层甚至双水相体系中上表层，实现相偏移效果；同时通过超滤技术，选用适当的超滤膜，可以将PEG 小分子过滤出来而阻隔蛋白子大分子通过，实现PEG组分的循环利用；还可以通过吸附、电泳以及离子交换等手段，利用蛋白子与PEG 电性质的差异，实现成相聚合物的循环利用。包括利用离子含量即相对分子质量降低高聚物排斥性，通过减缓双水相体系浓度提高抗生素分离效率方面的应用。通过双水相技术研究电泳过程中核内体中分离氨基酸的效果等；最后，通过亲和分配与双水相萃取技术结合使用，也可以有效节省PEG 的用量。通过利用表面活性剂组成的双水相萃取体系，用于成分分离检测，基于表面活性剂含量较少不会影响到生物活性物质活性，从而高效应用于生物活性物质的分离提纯过程。

4 结语

双水相萃取技术现已被广泛应用于基因工程、蛋白质工程等高新生物技术当中，但这些高新生物技术对生化分离技术的要求也更为苛刻，尤其是操作步骤更为繁琐、处理时间也更长，严重影响该项技术的工业化发展进程。分析双水相萃取技术的特征，就其温和高效的分离提纯过程，以及提纯过程不会使物质失活破坏的特点，通过不断完善该项技术的集成工艺，研发效率更高、技术可靠的双水相萃取技术，同时不断探索成本低廉的高聚物代替品，加快双水相萃取技术的工业化应用，是保障双水相萃取技术实现生物制药工业化，并高效快速发展的前提条件。