ChREBP 在HepG2 肝癌细胞糖脂代谢紊乱中的调控作用

曾炼坤 邱友燕 蒋婵 熊静妮 陈丹丹 李素燕 刘雪芳

肝癌是常见的高发病率和高致死率的恶性肿瘤，可导致肝功能受损，而肝脏属于代谢器官，肝功能受损往往伴随糖脂代谢异常情况发生[1]。因此，对其发生机制进一步研究并提出有效的防治对策具有重要意义。Ahn[2]在肝脏中发现了一个与肝脏丙酮酸激酶（LPK）启动子区碳水化合物反应元件（ChoRE）结合的转录因子，称为碳水化合物反应元件结合蛋白（ChREBP）。新近研究表明，在非胰岛素信号通路的作用下，糖代谢物可通过ChREBP 调控糖酵解及脂质合成关键酶的表达，进而影响肝内脂质沉积[3]。因此，本研究拟采用高血糖诱导的人HepG2 肝癌细胞，通过检测肝脏脂肪沉积，ChREBP入核，以及检测LPK 和脂肪酸合成酶（FAS）的表达，研究高浓度葡萄糖条件下肝脂质沉积的可能机制，为临床防治肝细胞癌提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞及培养人肝癌HepG2 细胞株购于上海细胞库，目录号：SCSP-510。采用RPMI1640 培养基（含有0.0625g/L 青霉素和0.1g/L 链霉素），在37℃、5%CO2饱和湿度的条件下，体外培养HepG2 肝癌细胞，当细胞贴壁率达到85%～90%后，再用0.25%的胰酶水溶液（含有0.02%的EDTA）对其进行酶解，通过台盼蓝拒染实验检测其存活率，其存活率在90%以上，再进行传代[4]。

1.2 细胞分组及给药根据文献，将HepG2 肝癌细胞分为3 组：对照组（葡萄糖终浓度为11mmol/L）、中糖组（葡萄糖终浓度为18mmol/L）和高糖组（葡萄糖终浓度为25mmol/L）[5]。

1.3 细胞内TG 含量的检测分别于干预后24h、48h 收取细胞，用预冷的PBS 清洗2 次，加入RIPA细胞裂解液，混匀后于冰上裂解30min，取上清，按照TC、TG 检测试剂盒说明书，采用GPO-PAP 法测定细胞内TG 含量。

1.4 细胞内脂滴含量的检测将18mm×18mm 的盖玻片放入6 孔板中，然后接种1×105个/mL 浓度的HepG2 肝癌细胞，1mL/孔，24h 后，给予25mmol/L的葡萄糖，分别作用24h 和48h，对照组与中糖组分别给予11mmol/L、18mmol/L 的葡萄糖，其他步骤与高糖组相同。通过PBS 冲洗、4%PVA 固定、油红-O染色、苏木素细胞核二次染色等方法，对细胞内橙红色的脂滴进行计数[6]。

1.5 细胞内ChREBP 核转位的观察加入葡萄糖处理3、6、12、24h 后，参考 ChREBP 的细胞转运工具包，进行细胞核转运实验。以100 个细胞为单位，选择6 个高放大倍率的区域，对其进行核转位检测。

1.6 细胞LPK 基因mRNA 表达量的检测应用RT-PCR 方法检测。分别在0、12、24、36、48h 时，采用Trizol 法提取总RNA，以此为模板，测定其纯度及完整性；应用RT-PCR 方法对LPK 基因进行扩增。LPK 的引物序列为：5'-CTCTGCCTACTGGACATTGACTCC-3'；5'-CTCTGCCTACTGGACATTGACTCC-3'；内参β-actin 的引物序列为：5'-GGGGCCTGCTGCCTTCCTCCTTCCTGCTCCTG-3'，5'-CGTCATACTCCTGCTTCCTGCT-3'，全长540bp。所有引物由BauerBiology（大连）有限责任公司合成。在94 ℃下，进行5min 的PCR 反应。结果表明，在94℃下，样品的变形时间为30s，在55℃下，样品的热处理时间为30s，在72℃下，样品的延伸时间为30s，共35 次。在72 ℃时，可延长10min。用1.5%的琼脂糖电泳对PCR 反应的结果进行鉴别，用溴化乙啶进行染色，用凝胶成像机进行显像，用Quntityone 图像分析软件对PCR 反应的结果进行分析；将样品与β-actin 的总光学密度之比作为LPK基因表达量。

1.7 细胞FAS 蛋白表达的检测使用免疫印迹法检测FAS 蛋白。在高糖环境下24h 和48h 后，以 BCA法检测其含量，以6%的SDS-PAGE 电泳分离，再以5%的脱脂乳粉对其进行封闭。用1:1 000 稀释的FAS 抗体在4℃下孵育过夜。PBST 进行3 次清洗，并添加对应的二抗（以1:5 000 稀释的辣根过氧化物酶标记的小鼠抗兔IgG），并在室温孵育90min。将 PBST 清洗3 遍，添加ECL 化学发光试剂1mL，使用1min，将薄膜上的试剂吸干，置于暗盒中曝光，显影，定影；用Quntityone 影像分析软件对其进行分析，并将其与样品中β-actin 的积分光度之比作为其表达量。

1.8 统计学方法利用SPSS 22.0 软件包进行统计，数据以表示，多组对比采用单因素方差分析，两两组间对比采用t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 葡萄糖对HepG2 肝癌细胞内TG 含量的影响HepG2 肝癌细胞中TG 的含量随葡萄糖浓度的升高和作用时间的延长而升高。中糖、高糖组在24h时TG 的浓度较对照组稍有增高（t=0.631，1.047；P=0.357，0.135）；中糖、高糖组的TG 水平在48h时较对照组显著增高（t=5.352，5.896；P=0.0010，0.0008）。见表1。

2.2 葡萄糖对HepG2 肝癌细胞内脂滴含量的影响油红-O 染色后，在高糖环境下，脂肪细胞内出现较多的橘黄色脂肪颗粒。另外，在不同的发酵阶段，其油脂成分也有不同程度的增加。见图1。

表1 葡萄糖作用时间对各组HepG2 肝癌细胞内TG 含量的影响（μg/mg 总蛋白，，n=3）

表1 葡萄糖作用时间对各组HepG2 肝癌细胞内TG 含量的影响（μg/mg 总蛋白，，n=3）

注：与对照组比较，aP<0.01；与中糖组比较，bP<0.01；与24h 比较，cP=0.0074；cP=0.0017

2.3 葡萄糖对HepG2 肝癌细胞内ChREBP 核转位的影响在不同时间点及高糖处理组0h，ChREBP 以胞浆定位为主。在高糖状态下，3h 后，ChREBP 有缓慢的入核趋势。在6、12h 时，两组细胞的核移位显著增加，核移位的比例在20%左右。在24h 后，ChREBP 在细胞的核浆中逐渐降低。

2.4 葡萄糖对HepG2 肝癌细胞LPK 基因mRNA相对表达量的影响RT-PCR 检测发现，与对照组相比，高糖组在不同时间点上LPK 基因mRNA 的表达水平明显升高。高糖组LPK 基因的mRNA 表达量随血糖处理时间的增加而增加，12h 达到峰值，之后有下降趋势；在12（P=0.0014）、24（P=0.0020）及36h（P=0.0354）的表达水平均显著高于对照组。见表2。

图1 油红-O 染色观察HepG2 肝癌细胞内脂滴的含量（×400）

表2 葡萄糖作用时间对各组HepG2 肝癌细胞LPK 基因mRNA 相对表达量的影响（）

表2 葡萄糖作用时间对各组HepG2 肝癌细胞LPK 基因mRNA 相对表达量的影响（）

注：与0h 比较，bP=0.0017；与24h 比较，cP=0.0119

2.5 葡萄糖对HepG2 肝癌细胞FAS 蛋白表达的影响Western blot 结果显示，高糖组24、48h FAS 蛋白的表达水平明显高于对照组，两组差异有统计学意义（P=0.0030、0.0001）。见图2、表3。

图2 Western blot 分析HepG2 肝癌细胞FAS 蛋白的表达

表3 葡萄糖作用时间对各组HepG2 肝癌细胞FAS 蛋白相对表达量的影响（）

表3 葡萄糖作用时间对各组HepG2 肝癌细胞FAS 蛋白相对表达量的影响（）

注：与24h 比较，cP<0.01

3 讨论

ChREBP 是一种重要的转录因子，可直接活化LPK，进而调控肝细胞糖酵解。在离体实验中，我们发现 ChREBP 可促进小鼠肝脏 LPK 的表达。通过RNAi 沉默ChREBP，可以抑制25mmol/L 浓度的葡萄糖对LPK 的上调作用。ChREBP 可与 LPK 及其他下游基因启动子区相结合[7]。既往研究发现正常膳食诱导的ChREBP-/-小鼠丙酮酸比例降低，丙酮酸生成减少，糖酵解受到抑制。在此过程中，6-磷酸葡萄糖在肝组织中的含量增加[8]。在高糖条件下，ChREBP-/-小鼠的肝重量较对照小鼠增加了40%左右，提示其肝组织中糖原积累增加[9]。此外，我们还发现小鼠肝组织中与糖异生有关的酶（如葡萄糖6-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸激酶等）表达显著降低，提示其肝内葡萄糖和糖原增加并非由于糖异生增加，而是由于糖酵解被抑制所致[10]。ChREBP 是调控肝脏果糖代谢的关键分子。在肝脏中，果糖的代谢途径有别于肌肉、脂肪等组织。肌、脂等组织中的己糖激酶可磷酸化果糖，参与糖酵解或糖原合成，但在肝内，葡萄糖激酶对果糖的亲和力较弱，故依赖于肝内特异的果糖激酶[11]。果糖激酶（1-磷酸）将果糖转化为1-磷酸果糖（1-磷酸），将2-甘油醛（3-磷酸）转化为甘油醛（3-磷酸），进而将3-磷酸转化为糖原。我们前期工作发现，果糖代谢关键酶Glut5、Fructokinase 和 aldolaseB 均受到 ChREBP 的调节，且ChREBP 缺失导致果糖代谢紊乱和果糖不耐受。ChREBP-/-小鼠在高糖条件下数天就会死亡。高蔗糖日粮（能分解成葡萄糖、果糖）1 星期内死亡率超过50%[4]。

为此，本项目拟构建人HepG2 肝癌细胞株，观察高脂高糖条件下ChREBP、LPK 和FAS 的变化，明确高脂高糖诱导的ChREBP-LPK-FAS 信号途径导致肝内脂肪堆积的机制[12]。我们的实验结果表明：与正常的葡萄糖浓度（11mmol/L）相比，高糖所致的实验组大鼠HPG 肝细胞中的TG 水平明显增高，说明其可引起肝脂肪堆积；为此，我们提出假说：高糖可使ChREBP 进入细胞核，并与LPK 和FAS 等启动的ChoRE 相互作用，上调LPK 和FAS等基因的转录水平，从而上调其下游分子的转录水平。该研究与王欣等[13]的研究一致，课题组前期研究表明，在血糖敏感性的胰腺癌株832/13 中，ChREBP 在2h 后即表现出转录活力，3h 达高峰，且持续12h。血糖信号途径是一条快速响应途径，但是相对于其他途径，血糖信号途径不能产生快速的脱敏。ChREBP 作为一个重要的调节因子，可以调节肝细胞的糖脂代谢。有研究指出，糖脂代谢紊乱相对于健康小鼠，其糖代谢和脂代谢通路中LPK、ACC、FAS 等蛋白水平显著下降，肝内脂肪含量显著减少，糖耐量显著增加，食欲显著降低[14]。

综上所述，ChREBP 是一个在糖脂代谢过程中发挥重要作用的转录因子，其可能是一个潜在的防治脂肪肝的新靶点。