荧光PCR探针熔解曲线技术检测痰标本中结核分枝杆菌异烟肼耐药性的研究

王嫩寒 赵琰枫 田丽丽 陈双双 陈昊 任怡宣 李传友 代小伟

北京市疾病预防控制中心结核病实验室（北京 100035）

异烟肼是重要的抗结核药物［1］。目前，由于没有耐受性良好的抗结核药物出现，异烟肼仍作为重要的一线抗结核药物在使用［2］。异烟肼被结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）的过氧化氢-过氧化物酶KatG过氧化活化为异烟碱酰基自由基，可以与烯酰基还原酶-NAD复合体（MTB细胞壁的主要成分——分枝菌酸的生化合成途径中的关键成分）相结合，从而抑制其活性，最终通过影响MTB细胞壁的正常合成途径，使MTB丧失增殖等功能而达到抑菌的目的［3-4］。2018年，WHO的一份研究报道，据估计，全世界约8%的结核病患者为异烟肼耐药结核病［5］。2020年，全球结核病报告中指出，在活动性肺结核患者中，异烟肼耐药肺结核占15%，需尽快发现这部分患者，并选择合适的替代治疗方案［6］。然而，异烟肼耐药比单利福平耐药更常见，并可能严重影响抗结核治疗［7］。

传统的药敏试验建立在患者标本培养阳性的基础上，耗时长，易延误治疗。近年来，利用分子生物学方法检测耐药的技术迅速发展，但大多选择菌株进行检测，时效性较差。若能直接检测患者标本，则能及时得到药敏结果，为患者制定个体化治疗方案赢取宝贵时间。本研究应用MeltPro技术对痰标本直接进行MTB异烟肼耐药检测，评价该方法直接对肺结核患者痰标本进行MTB异烟肼耐药筛查的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2021年5月至2022年5月在北京市疾病预防控制中心结核病门诊就诊的初治肺结核患者痰标本，纳入标准：（1）GeneXpert MTB/RIF检测结果MTB阳性；（2）痰标本量＞ 3 mL。对收集到的痰标本进行涂片镜检及分枝杆菌分离培养，培养阳性菌株进行异烟肼比例法药敏检测；用MeltPro技术及Hain试验对痰标本直接进行MTB异烟肼耐药检测。

1.2 检测方法

1.2.1 涂片镜检按照《结核病实验室检验规程》［8］，选取适量痰标本进行涂片，随后进行萋-尼氏抗酸染色（染液由珠海贝索生物技术有限公司生产），100倍油镜下进行检测。对检测结果进行分级，即“阴性”、“1 ～ 8条/300视野”、“1+”、“2+”、“3+”、“4+”。

1.2.2 分枝杆菌分离培养按照《结核病实验室检验规程》，吸取1 nL痰标本放入前处理管中，加入1 ～ 2倍体积4% NaOH，旋紧处理管螺旋盖，震荡混匀，使痰标本充分液化，室温下静置15 min后，均匀接种于酸性罗氏培养基（河南赛诺特生物技术有限公司生产）上，每支0.1 ～ 0.15 mL，旋紧螺旋盖，在（36 ± 1）℃孵育，直至长出可视菌落，记录生长情况。培养8周无菌落生长者报告“阴性”。

1.2.3 结核分枝杆菌比例法药敏试验参照《结核病实验室检验规程》的结核分枝杆菌固体药敏试验操作，使用细菌超声分散计数仪BAC spreader 1100C（广东希格生物科技有限公司）、中性罗氏培养基、含药培养基（异烟肼，0.2 μg/nL），对培养阳性菌株进行异烟肼比例法药敏试验，同时用对硝基苯甲酸/噻吩-2羟酸肼（PNB/TCH）培养基鉴定是否为结核分枝杆菌。所用培养基均由河南赛诺特生物技术有限公司生产。TCH培养基上有菌落生长，PNB培养基上无菌落生长者为结核分枝杆菌；PNB培养基上有菌落生长，TCH培养基上无菌落生长者为非结核分枝杆菌。耐药百分比（%）=含药培养基上生长的菌落数/对照培养基上生长的菌落数×100%。若耐药百分比＞ 1%，则认为受试菌对该药耐药。

1.2.4 MeltPro技术耐药检测使用厦门致善生物科技股份有限公司生产的结核分枝杆菌耐药试剂盒，以及SLAN-96S Real-Time PCR System（上海宏石医疗科技有限公司）进行MTB异烟肼耐药检测及结果分析。吸取1 mL痰标本加入到50 mL圆底离心管内，再加入1 ～ 2 mL前处理液（NALC-NaOH），室温下震荡混匀15 min，加入40 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中和离心（3 000 ×g离心18 min），弃上清，加1 mL的PBS进行重悬沉淀，10 000 ×g离心1 min，弃上清。在沉淀中加入300 μL试剂盒中提供的TB-DNA提取液，90 ℃加热10 min，10 000 ×g离心1 min，吸取上清液，得到结核分枝杆菌DNA。按说明书要求配置PCR反应液，在20 μL反应液中加入5 μL结核分枝杆菌DNA，使用SLAN-96S Real-Time PCR System进行MTB异烟肼的耐药检测及结果分析，反应程序参照说明书。通过比较所检测样本与阳性对照样本之间熔解曲线熔点（Tm）值的差异判断样本是否发生突变：样本的熔点与阳性对照的熔点一致，误差不超过1 ℃时，判定为野生型，待检样本对所检测药物敏感；样本的熔点低于阳性对照2 ℃及以上时（ΔTm≥ 2 ℃），判定为突变型，待检样本对所测药物耐药。若结果为结核分枝杆菌未检出或耐药不明确，则检测不成功，需重复检测。

1.2.5 Hain试验用德国海因生命科学有限公司生产的结核分枝杆菌复合群及耐药基因突变检测试剂盒（PCR-线性杂交酶显色法）试剂盒以及生物梅里埃公司的GT-Biot48结核分枝杆菌耐药快速检测系统进行Hain试验。将方法4中提取的结核分枝杆菌DNA 5 μL加入45 μL扩增混合物中，按照说明书的扩增程序进行扩增。扩增完成后取20 μL扩增产物进行杂交，杂交过程包括化学变性、杂交孵育、洗涤、偶联和显色等。根据显色结果进行耐药情况的判读。判读标准：所有野生条带均显色且突变条带无显色时为敏感；野生条带缺失不显色或突变条带显色为耐药。

1.2.6 GeneXpert MTB/RIF检测GeneXpert MTB/RIF检测仪及试剂盒由美国赛沛公司生产。按照GeneXpert MTB/RIF检测说明书要求操作，取1 nL痰标本置于螺旋盖前处理管中，加入2倍体积的检测样品试剂，旋紧前处理管，室温下振荡混匀15 min，使痰标本充分液化，打开检测匣，取2 mL处理后的样品，由加样孔缓慢加入检测匣中，放置到检测模块，仪器开始自动化检测。该技术针对rpoB基因81 bp利福平耐药核心区间（RRDR）设计引物和探针，检测其是否发生突变，用于辅助诊断是否为结核分枝杆菌，以及是否对利福平耐药。基于样本中MTB的Ct值，MTB结果以高、中、低和极低显示，Ct值 ＜ 16为MTB含量高，Ct值在16 ～22之间为MTB含量中等，Ct值在22 ～ 28之间为MTB含量低，Ct值 ＞ 28为MTB含量极低。

1.3 质量控制按照《结核病实验室检验规程》相关规定，完成涂片镜检及分枝杆菌分离培养的质量评估，项目质量合格。药敏试验所用培养基均用标准菌株H37Rv进行含药培养基质量控制。实验室每年参加中国疾病预防控制中心结核病参比实验室组织的药敏试验熟练度测试，成绩优秀。MeltPro技术耐药性检测选用含有相应野生型靶扩增基因的质粒作为阳性对照，既完成了结果的判读，又保证了检测的质量。每次Hain试验都用标准菌株H37Rv与其他标本一起完成检测。每个测试条都包含5个质控条带：（1）标记物质控带：用于确认探针试纸条上的标记物结合情况及正确的显色反应；（2）扩增质控带：用于确认PCR扩增反应是否成功；（3）3个基因位点质控带，用于确认每个基因位点反应的最佳敏感度。GeneXpert MTB/RIF检测每个检测匣包括样本处理质控（SPC），确保样品经过正确处理；以及探针检查质控（PCC），保证探针检查合格。

1.4 统计学方法采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量资料呈偏态分布时以［M（Q1，Q3）］描述，计数资料以“例数”和“百分率/构成比（%）”描述，采用χ2检验或Fisher精确概率法及Kruskal-Wallis H检验进行组间差异的比较，以P＜ 0.05为差异有统计学意义。以比例法药敏结果为参考标准，计算MeltPro技术检测异烟肼的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和Kappa值。Kappa值用于一致性检测，0 ～ 0.2为一致性极低，0.21 ～ 0.4为一致性一般，0.41 ～ 0.60为中等一致，0.61 ～ 0.80为基本一致，0.81 ～ 1.00为几乎完全一致。

2 结果

2.1 一般情况本研究共收集157例MTB阳性痰标本，其中男115（73.2%）例，女42（26.8%）例。年龄范围16 ～ 88岁，年龄中位数（四分位）为46（31，64）岁。157例MTB阳性的痰标本，经分枝杆菌分离培养，获得阳性菌株130株，培养阳性率为82.8%（130/157）。培养阴性19例，污染8例。污染率为5.1%（8/157）。130株阳性菌株均进行了比例法异烟肼药敏试验。用MeltPro技术进行异烟肼耐药筛查，检测成功132例，失败25例，检测成功率为84.1%（132/157）。Hain试验异烟肼耐药检测成功125例，失败32例，检测成功率为79.6%（125/157）。同时有MeltPro技术异烟肼耐药检测和比例法药敏试验结果的115例；同时有Hain试验异烟肼耐药检测和比例法药敏试验结果的109例。在27例培养阴性的标本中，MeltPro技术检测MTB异烟肼耐药基因突变9例，敏感8例，检测不成功10例。见图1。

图1 标本检测情况Fig.1 Sample testing process

2.2 痰标本荷菌量对MeltPro技术耐药检测的影响157例MTB阳性的痰标本中，MeltPro技术异烟肼耐药检测成功的比例随着痰涂片结果等级的升高而升高，各等级间差异有统计学意义（H=24.169，P= 0.000）。见表1。检测成功率也随着GeneXpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌等级的升高而升高，各等级间差异有统计学意义（H= 27.763，P= 0.000），见表2。

表1 痰涂片不同等级与MeltPro技术异烟肼耐药检测成功的关系Tab.1 The relationship between different grades of sputum smear and the success of Isoniazid resistance detection by MeltPro technique例（%）

表2 GeneXpert MTB/RIF检测MTB不同等级与MeltPro技术异烟肼耐药检测的关系Tab.2 The relationship between the different grades of MTB detected by GeneXpert MTB/RIF and the detection of Isoniazid resistance by MeltPro technique例（%）

2.3 MeltPro技术异烟肼耐药基因突变的检测效能MeltPro技术的异烟肼耐药检出率为22.0%（29/132），Hain试验的异烟肼耐药检出率为15.3%（19/124），比例法的异烟肼耐药检出率为14.6%（19/130），三者差异无统计学意义（χ2= 2.997，P= 0.223）。

以比例法药敏试验结果为金标，MeltPro技术检测异烟肼耐药的灵敏度为84.6%（11/13），特异度为91.2%（93/102），阳性预测值为55%（11/20），阴性预测值为97.9%（93/95），MeltPro技术检测异烟肼耐药与比例法药敏试验结果一致性Kappa值0.614，为基本一致。见表3。

表3 MeltPro技术和Hain 试验检测异烟肼耐药性的效能Tab.3 Efficacy of MeltPro technique and Hain test in detecting Isoniazid resistance

2.4 异烟肼耐药基因突变情况157例（份）标本中，MeltPro技术检测异烟肼耐药基因突变29例，Hain试验检测异烟肼耐药基因突变19例，具体突变位点见表4。异烟肼耐药基因突变而比例法药敏结果敏感的12例，耐药基因无突变而比例法药敏结果耐药的7例。

表4 异烟肼耐药突变位点及药敏试验结果Tab.4 Isoniazid resistance mutation site and drug sensitivity test results

3 讨论

表型药敏试验包括固体药敏和液体药敏（MGIT960药敏试验和优化肉汤微孔板法药敏试验）。固体药敏试验需4周以上得到药敏结果，液体药敏试验也需要7 ～ 21 d才能得到结果，耗时均较长［9］。MeltPro技术是一种快速检测耐药基因突变的方法，检测利福平和异烟肼耐药的试剂平均成本约200元/人份，耗时约3 h。大大缩短了检测时间。2008年，WHO推荐使用第一代线性探针技术进行快速耐多药诊断［10］。Hain试验可同时检测异烟肼和利福平耐药情况，试剂平均成本约230元/人份，检测时长约6 h。与之相比，MeltPro技术可同时检测异烟肼、利福平、氟喹诺酮类药物、链霉素及乙胺丁醇的耐药情况，能更快筛查出MDR-TB及Pre-XDR-TB。为临床医生因人施治提供依据。

本研究选用157例MTB阳性的痰标本进行MeltPro耐药检测，涂片阴性痰标本检测成功率64.8%，涂片1 ～ 8条/300视野痰标本检测成功率89.5%，涂片“1+”痰标本检测成功率89.7%，涂片“2+”痰标本检测成功率96.9%，涂片“3+”及“4+”痰标本检测成功率均100%，随着涂片阳性等级升高，检测成功的比例相应升高。涂片阳性痰标本检测成功率较高，能获得可靠的耐药信息。与赵国连等［11］报告的结果基本一致。因此MeltPro技术可以直接用于痰标本的耐药检测。该比例也随GeneXpert MTB/RIF检测MTB等级的升高而升高。结核分枝杆菌阳性等级达到“中”和“高”时，检测成功率分别为95.8%和96.4%。本实验采用粗提法从痰标本中提取结核分枝杆菌DNA，操作简便快捷，适用于基层实验室。但粗提法提取效能有限，不能保证DNA纯度及浓度，可能会干扰耐药检测结果［12］。另外，病原学检测结果的敏感性与痰标本质量密切相关［13］，若能提高痰标本质量，势必能提高MeltPro技术的检测效能。

在本研究中，MeltPro技术检测异烟肼灵敏度为84.6%，特异度91.2%，敏感度高于刘春平等［14］报道的数据，特异度稍低（72.9%，100%）；与Hain试验相比较，敏感度较高，特异度稍低（55.6%，92.3%）；与比例法药敏试验结果一致性比较，kappa0.614，为基本一致。

本研究中，在27例MTB阳性但培养阴性、无法进行传统药敏试验的标本中，MeltPro技术检测MTB异烟肼耐药基因突变9例，敏感8例，检测不成功10例。提示MeltPro技术对痰标本直接进行检测，可为培养阴性结核病患者提供耐药筛查结果，弥补了因无阳性菌株造成药敏结果缺失的不足。

本研究中，有些标本的分子耐药检测与比例法药敏结果不一致，均已进行了重复实验。MeltPro技术检测异烟肼耐药与表型药敏试验结果有19例不符，其中基因型检测敏感而表型药敏耐药的7例，基因型耐药突变而表型药敏敏感12例。造成基因型和表型耐药结果不符的原因可能有：（1）MeltPro技术检测的基因突变的区域位点为ahpC启动子区（-40 ～ -30及-15 ～ 3位点），inhA94密码子，inhA启动子区（-17 ～ -8）位点和KatG315密码子区。除此之外，已知的异烟肼的耐药突变位点还有fabGl、kasA、iniA/B/C、ndh、fadE、furA、Rvl592c和Rvl772及其启动子区等［15］。在KHAN等［16］的研究中，最常见的异烟肼突变位点为katG S315T，其次为fabG1-15C＞T（inhA启动子）和inhA-154G＞A。另外，CHEN等［17］对WHO提供的耐药MTB菌株的数据进行了研究，发现虽然91%的异烟肼耐药菌株存在已知的耐药位点基因突变，仍有9%的耐药菌株存在未知的突变位点。所以，造成本研究中出现7例样本基因型敏感而表型药敏结果耐药的原因可能为存在该方法涵盖的突变位点之外的耐药基因突变。（2）根据说明书中的陈述，MeltPro技术检测异烟肼耐药野生型的检测限为2 × 103菌/nL，突变型检测限为104菌/nL。本研究采用粗提法提取MTB的DNA，提取效能有限，可能造成核酸浓度低于该方法的检测限，未能检测到突变位点的存在，导致表型药敏试验结果耐药而基因型检测结果为敏感。（3）抗菌药物折点是用来判断病原菌对药物敏感、中介或耐药的MIC值［18］，多年来，抗结核药物的折点几经修订，目前，中国和WHO推荐的异烟肼表型耐药的折点为0.2 μg/mL，CLSI的推荐标准为0.25/1.0 μg/mL。一些耐药相关基因会产生低水平耐药［19］，本研究采用比例法药敏检测为标准，异烟肼耐药培养基只有一个药物浓度，可能导致表型耐药而基因型检测敏感。（4）若患者存在敏感菌和耐药菌的混合感染，通常在培养过程中，敏感菌生长优于耐药菌，导致培养物中耐药菌的比例下降，出现表型结果假阴性［20］。后续可对菌株进行MeltPro技术耐药筛查，探讨异质性耐药对分子耐药检测和表型药敏结果的影响。（5）本研究中，基因型耐药突变而表型药敏敏感的比例为9.23%（12/130），龚兰等［21］研究发现，9.79%的异烟肼敏感结核分枝杆菌株发生的katG、inhA基因突变，研究结果基本一致。本研究采用粗提法提取MTB的DNA，若能提高痰标本质量，并对粗提DNA进行纯化或采用提取效能高的方法或仪器进行核酸的提取，可极大提高MeltPro技术的检测成功率。再者，对表型药敏试验与分子耐药结果不符合的标本，应进一步行全基因组测序等检测，分析不一致的原因；本研究受经费和课题时间的限制，耐药标本收集数量有限，在后续条件允许的情况下，将收集更多耐药痰标本进行深入研究。

总体来说，对GeneXpert MTB/RIF检测为MTB的肺结核患者，直接使用MeltPro技术对痰标本进行异烟肼耐药筛查具有灵敏度高，特异性强，操作简便等特点，可缩短检测时间，为临床提供快速准确的耐药结果。同时，MeltPro技术对DNA的浓度及纯度有较高要求，若能保证DNA浓度及纯度，可以极大提高检测的成功率。