m6A修饰在脊髓损伤恢复中的研究进展

张东旭 赵欣华 蒋焕莹 周立新 孙忠人 尹洪娜

黑龙江中医药大学附属第二医院针灸七科（哈尔滨 150006）

脊髓损伤（SCI）是一种严重的中枢神经系统（CNS）损伤疾病，常导致患者损伤平面以下的运动、感觉及自主神经功能障碍［1］。SCI按发病机制可分为原发性和继发性（SSCI）两类，其中原发性SCI为外伤及暴力等造成的血管结构损伤、轴突破裂等机械性损伤；SSCI则常因原发性SCI产生的位移、血肿、压迫等未及时解除，导致损伤部位产生如炎症、细胞凋亡、胶质瘢痕等持续性病理改变［2］。这种由SSCI产生的不利于神经功能恢复的微环境也是SCI后难以恢复，具有较高的致残率的原因，故对于SSCI的治疗是SCI恢复的关键［3］。

N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物必不可少的转录修饰［4］，已证实与神经系统疾病的病理发展密切相关［5］。研究［6］发现，SCI后损伤部位m6A的修饰水平发生了变化，m6A相关调节因子参与了SSCI后损伤部位微环境的发展与变化。因此，m6A修饰相关调节因子可能是促进SCI恢复的潜在治疗靶点。本文就m6A参与的SCI恢复的可能机制研究现状进行综述，以期为SCI的治疗提供新思路。

1 m6A修饰

Conrad Waddington于1942年首次提出表观遗传修饰的概念［7］，这种修饰方式可通过一些化学修饰，在不改变基因序列的情况下，通过DNA、RNA、蛋白质三个层面的修饰，调控基因的表达。其中RNA的化学修饰则被证实较多参与了CNS疾病的病理过程［8］。在已知的170多种RNA修饰中，m6A修饰具有高度动态性和选择修饰性，可通过翻译、剪切、降解及稳定性的变化决定RNA的命运［9］。m6A修饰这一过程是动态的、可逆的、保守的，依赖多种相关蛋白及酶，主要为甲基转移酶、去甲基酶、m6A结合蛋白三类［10］。近年来，随着测序技术的发展，大量研究表明，m6A修饰在一些疾病进展中发挥重要的作用。

2 m6A修饰的多维机制

2.1 甲基转移酶细胞内RNA的甲基化通常需要各种酶的共同催化，这些酶被称为“Writers”。作为m6A修饰中的“编码器”，甲基转移酶复合物，包括甲基转移酶样3（METTL3）及甲基转移酶样14（METTL14）及其他相关酶，如肾母细胞瘤相关蛋白1（WTAP）［11］。自1997年METTL3首次发现以来，其一直被广泛研究，已知是甲基酶复合物的催化核心，能通过稳定募集到特定的基因位点和促进RNA转运到核糖体影响翻译效率进而影响基因表达［12］。另一种酶METTL14虽不具有催化作用，但其可与METTL3起协同作用，一方面与METTL3形成二聚体的稳定复合结构；另一方面可通过与RNA底物结合起到增加METTL3甲基转移酶活性的作用［13］。除了METTL3和14，WTAP的作用也值得探讨。WTAP在甲基化酶复合物中发挥调节作用，将复合物与RNA连接起来，WTAP的缺失会导致异常的基因表达和可变剪接［14］。

2.2 去甲基酶m6A去甲基化酶可以从核苷酸中去除甲基，通常称为“Erasers”，其发现表明RNA的m6A修饰是动态并可逆转的［10］。肥胖相关蛋白（FTO）和ALKB同系蛋白5（ALKBH5）是常见的“解码器”，可以有效降低m6A修饰水平。FTO是第一个被发现的去甲基酶，其对于m6A修饰的去除是通过氧化反应实现的，并在mRNA的降解、翻译中发挥重要作用［15］。研究［16］还发现，FTO参与了不同情况下的神经系统疾病的病理发展。ALKBH5是另一种能够逆转m6A修饰的酶，研究［17］发现ALKBH5的失活可导致mRNA上的m6A水平显著升高。此外，ALKBH5也与转录后RNA调节有关，可紧密地与RNA底物结合，影响RNA的表达水平［18］。

2.3 m6A结合蛋白作为m6A修饰中的“读码器”，这些结合蛋白可以与m6A修饰位点结合直接或间接影响RNA翻译、剪接和解体等生物过程，常被称为“Readers”。其中值得关注的是YT521-B同源结构域家族蛋白（YTHDFs、YTHDCs）、异质核糖核蛋白（HNRNPs）和胰岛素样生长因子2（IGF2）。YTH家族因其特有的RNA结合位点可直接调控位于细胞核及细胞质中的m6A修饰靶基因，进而对RNA产生影响［19］；HNRNP家族则可通过调控位于细胞核中RNA底物的成熟过程，从而影响目标RNA的丰度和剪接［20］。IGF2是最新研究发现的m6A结合蛋白，可以保护m6A修饰的mRNA免于降解［21］。上述结合蛋白都在与m6A修饰的甲基化位点结合后，识别并解析其相关生物功能的指令，进而发挥对下游分子的调控作用。见图1。

图1 m6A修饰机制图Fig.1 Mechanism diagram of m6A modification

3 m6A修饰在SCI后的生物学作用及机制

3.1 m6A修饰与炎症SCI后损伤部位的炎症微环境对预后的影响不容忽视，作为SCI后最早做出反应的免疫细胞，小胶质细胞参与了激活炎症的级联反应，加重了继发性损伤，是影响SCI后炎症的关键因素［22］。

小胶质细胞具有促炎型M1和抗炎型M2两种表型。SCI常促使小胶质细胞向M1型极化［23］。M1型小胶质细胞在发挥防御作用的同时，也会加重神经炎症和神经细胞损伤，影响神经功能的恢复［24］。因此，对于小胶质细胞极化的调控可能有助于神经恢复并减轻继发性损伤。研究发现m6A修饰在小胶质细胞极化中可能起到了关键作用。ZHOU等［25］的研究发现，对于m6A读取器YTHDC1的特异性敲除导致了小胶质细胞向M1型极化，促进了炎症反应。WEN等［26］的研究发现，过表达METTL3可促使小胶质细胞向M1型极化，其机制可能是METTL3以m6A依赖的方式激活了TRAF6-NF-κB通路，导致小胶质细胞向促炎型转化，并产生炎性反应。DING等［27］的研究发现，IGF2BP1是控制小胶质细胞过度激活的潜在治疗靶点，其可通过与靶标3'UTR结合加强m6A修饰水平调节小胶质细胞的炎性反应。此外，另一项研究［28］通过生物信息学的方式发现M0、M1、M2三种表型小胶质细胞中lncRNA的m6A修饰水平存在差异，且M1型在m6A修饰中表现出最显著的变化，这些具有修饰差异的lncRNA可以通过改变各种免疫系统和信号转导过程来调节小胶质细胞的炎症反应。研究［28］发现，m6A修饰与调节小胶质细胞炎症反应的基因表达同样具有动态、复杂的关系。综上，m6A修饰可通过多种途径对小胶质细胞表型产生影响，而通过对m6A水平的调控可能减轻SCI损伤部位的炎性反应，但目前对于SCI后特定调节因子、细胞表型及机制联系的研究仍处于初始阶段，未来可于此方向进一步研究。

3.2 m6A修饰与细胞凋亡细胞凋亡是神经系统中细胞程序性死亡的一种常见形式［29］。神经元细胞凋亡是SSCI造成脊髓神经元死亡的主要原因，常在SCI后24 h内大量发生［30］。因此，抑制细胞凋亡对于减轻继发性损伤及帮助神经功能重建至关重要。最近研究发现，m6A甲基化修饰与细胞凋亡关系密切。

一项大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠的研究［31］中发现，m6A读取器YTHDF1在MCAO大鼠脑组织中表达上调，对于YTHDF1特异性敲除不但减轻了损伤脑组织的细胞凋亡和神经元损伤，还限制了梗死面积。此外，METTL3对于细胞凋亡的影响同样值得注意，METTL3特异性失活诱导的m6A修饰会使小鼠新生小脑颗粒细胞大量凋亡，从而导致小脑发育不良［32］；小鼠海马体中的METTL3缺乏则会增加局部细胞凋亡并改变细胞周期［33］。WANG等［34］的研究发现，SCI后大鼠RNA中METTL14含量及m6A修饰水平显著升高，但抑制损伤局部METTL14表达可降低大鼠的整体m6A修饰水平，并且观察到神经元兴奋性的增加及大鼠运动功能的恢复。此外，该研究还通过体外实验发现，METTL14的过表达促进了pri-miR-375向抑制细胞增殖的miR-375的转化，从而诱导了细胞凋亡［34-35］。另一项研究［36］发现，真核蛋白翻译延伸因子1A2（EEF1A2）的表达对于细胞凋亡具有抑制作用，但SCI后METTL14的表达上调并通过介导EEF1A2的m6A修饰水平，下调了EEF1A2的表达，从而促进了SCI后的细胞凋亡。GAO等［37］的研究通过沉默METTL14发现，SCI大鼠EEF1A2表达上调，抑制了损伤部位细胞凋亡的同时还减少炎症细胞因子的产生及脊髓中的神经元变性。通过上述研究可发现，甲基转移酶在抑制SCI后细胞凋亡中有着不可替代的作用，可最大程度降低继发性损伤带来的细胞死亡，通过甲基转移酶调控损伤部位m6A修饰水平有望成为SCI靶向治疗的新方向。

3.3 m6A修饰与胶质瘢痕SCI后星形胶质细胞活化为反应性星形胶质细胞，胞体肥大、增殖，并向损伤部位迁移，形成胶质瘢痕［38］。这种瘢痕早期可限制炎症扩散，而随着疾病进展，胶质瘢痕形成物理屏障，并释放轴突生长抑制因子，影响了神经功能的恢复［39-40］。因此，探究m6A修饰对于胶质瘢痕形成的影响可能为SCI的治疗开辟新的研究领域。

最近的研究发现，m6A修饰可以调节星形胶质细胞的生理功能。TENG等［41］的研究发现，在脑黑质中特异性敲除METTL14后，黑质中mRNA的总m6A修饰水平显著降低，并激活了星形胶质细胞，使小鼠的运动功能显著下降。HUANG等［42］的研究发现circSTAG1是重度抑郁症小鼠海马中表达显著下调的一种circRNA，其可通过与ALKBH5结合，降低ALKBH5介导的脂肪酸酰胺水解酶（FAAH）mRNA的m6A修饰水平，从而限制星形胶质细胞中FAAH的表达，达到减轻小鼠海马中星形胶质细胞功能障碍、减少星形胶质细胞丢失的作用。对于SCI后星形胶质细胞及胶质瘢痕的影响，GE等［43］的研究表明，相较于单纯SCI模型组，选择性删除METTL3的SCI模型组星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达降低，证明损伤部位反应性星形胶质细胞的数量降低，抑制了胶质瘢痕形成。XING等［44］的研究发现，SCI后METTL3在星形胶质细胞中的表达显著增加，这可能对星形胶质细胞的形态和功能产生了影响，但对于METTL3的变化对胶质瘢痕的影响还需进一步实验阐明。另一项体外实验［34］发现，在用H2O2模拟SCI诱导的细胞凋亡后，METTL14敲除显著减少了C8-D1A小鼠星形胶质细胞的细胞凋亡，这意味SCI后m6A的修饰水平与星形胶质细胞的存亡密切相关，而对m6A修饰水平的影响可能对SCI后胶质瘢痕的形成产生调控作用。总之，SCI后损伤部位m6A修饰水平的异常变化可能激活了星形胶质细胞，并于损伤部位生成胶质瘢痕，导致神经功能的恢复受到抑制，但由于此方面研究仍较少，m6A修饰与SCI后胶质瘢痕的关系仍需进一步深入探究。

3.4 m6A修饰与轴突再生SCI后运动功能障碍的主要原因是神经环路连续性被破坏［45］。轴突作为神经传导功能的重要因素，促进轴突再生及髓鞘化是神经环路重建的关键［46］。既往研究［47］寄希望于移植外源细胞促使其向神经元转化来修复神经环路。最近对m6A修饰的研究发现RNA修饰可以影响轴突再生。

在神经系统中，神经元轴突的再生受到m6A修饰的影响。YU等［48］研究表明，正常状态下FTO即在神经元的轴突中表达以维持轴突中m6A修饰水平的稳定，将轴突中FTO特异性敲除后，与神经元发育及轴突生长关系密切的生长相关蛋白43（GAP-43）mRNA的m6A修饰水平显著升高，从而减少了GAP-43 mRNA的局部翻译并抑制了轴突生长。此外，YTHDF1和YTHDF2则被证明分别作用于Wnt5a信号通路的两个关键因子Wnt家族成员5A（Wnt5a）和散乱片段极性蛋白1（Dvl1）而后协同起到对轴突生长的负调控作用，而抑制YTHDF1及YTHDF2的表达可以促进颗粒细胞中的轴突生长［49］。ZHUANG等［50］研究发现YTHDF1介导的m6A修饰对轴突导向受体3.1（Robo3.1）mRNA的翻译起到正向调控的作用，抑制Robo3.1蛋白水平在交叉后的轴突中降低，从而控制脊髓中的预交叉轴突导向。在一项斑马鱼和小鼠的SCI实验［44］中，研究人员对损伤部位组织进行MeRIP-seq、RNAseq等测序技术后发现，共计84个基因的mRNA在SCI后m6A修饰水平显著改变，这样的数量虽然不算庞大，但其中如hsp90ab1、taf1、igf2bp1及tp53等均已被证明在轴突生长和神经元发展中发挥重要作用，提示m6A修饰可能参与了SCI后轴突及神经元的生长发育，这是关于RNA m6A修饰在SCI中的作用的首次研究。此外，SCI后对轴突生长特异性标记的抗乙酰化微管蛋白（AcTub）表达下调，说明轴突生长受到抑制，而对METTL14进行敲除后AcTub的表达显著上调，这表明METTL14对SCI后轴突生长具有调控作用［34，51］。总之，轴突再生是神经环路重建的关键，也是SCI患者功能恢复的关键，m6A修饰可能是促进SCI后轴突再生的潜在机制，调控m6A修饰水平的同时若可配合电针等针灸疗法，可能对于患者的功能恢复产生意想不到的效果。见图2、表1。

表1 m6A修饰相关蛋白在SCI中作用机制汇总表Tab.1 Summary of the mechanisms of m6A modification related proteins in spinal cord injury

图2 m6A修饰相关蛋白在SCI中作用机制图Fig.2 Mechanisms of m6A modification related proteins in spinal cord injury

4 总结与展望

作为RNA表观遗传学的关键部分，m6A修饰是一种动态修饰的过程，其水平由甲基转移酶、去甲基酶及相关结合蛋白的变化共同影响。研究［52］已证实，在已知的170多种RNA甲基化修饰中m6A甲基化修饰在脊椎动物中含量最高，参与了多种神经系统疾病进程。尽管关于m6A甲基化修饰在阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化等神经系统疾病中的作用已有相关研究［53］，但关于这种翻译后修饰在SCI中作用的研究仍处于起步阶段。本综述详细概述了m6A甲基化修饰的研究现状以及m6A甲基化修饰相关调节因子在SCI后如炎症、细胞凋亡、胶质瘢痕形成、轴突再生等病理生理过程中发挥的作用，提示m6A甲基化修饰在SCI的治疗中存在巨大的应用潜力。

但目前对于SCI后m6A修饰的研究存在如下问题，SCI后继发性损伤的发病机制较为复杂，关于m6A修饰对SCI影响的具体机制的研究数量仍较少且研究内容多以“甲基转移酶”入手，还需要对SCI后去甲基酶和结合蛋白的影响进行更多研究；除细胞凋亡外，尚未有SCI后其他细胞死亡方式同m6A修饰的研究；髓鞘再生及突触形成对于SCI后神经环路重建同样意义重大，但目前鲜有研究，期待研究人员的进一步深入研究，为m6A修饰减轻SCI后继发损伤提供重要依据。作为SCI潜在治疗方式，这种动态修饰过程可能成为影响SCI病理过程和促进脊髓功能恢复的有效治疗策略，在未来的研究中期待以m6A修饰为靶点的药物或其他治疗方式的诞生，作为更加精准且有效的SCI治疗方式，对减轻患者的病痛具有重要意义。