吴茱萸碱胃漂浮片制备及其对家兔胃黏膜损伤的保护作用

2023-11-23 10:57张佩琛郝海军
中成药 2023年11期
关键词:碳酸氢钠吴茱萸家兔

张佩琛,方 栋,郝海军

(1.郑州澍青医学高等专科学校,河南 郑州 450064; 2.河南大学,河南 郑州 450000; 3.上海雷允上药业有限公司,上海 201401)

吴茱萸碱是吴茱萸主要活性成分之一,属于吲哚类生物碱[1],具有抗肿瘤、镇痛、抗炎、调节内分泌等作用[2-4],可通过调节JAK2/ STAT3 通路蛋白表达、抑制胃黏膜组织Gli1-Gli2-Sufu 信号通路转导等机制来抑制胃溃疡炎症反应、氧化应激,从而减轻组织损伤[5-7],有潜力开发成治疗胃溃疡或胃部疾病的新药[8]。研究表明,吴茱萸碱在胃部有一定吸收,适合制成胃滞留给药制剂[9],但尚未见该成分首关效应的报道。

胃滞留给药系统是指口服制剂可长时间滞留于胃部,从而实现定位释药,可减少药物损失,有助于提高胃部疾病的治疗效果[10-13]。胃漂浮片通过保持自身密度小于胃内容物密度来实现漂浮,从而成为长时间缓慢释放药物的储库,可实现靶向、长效治疗,并且该制剂制备工艺简便,容易实现工业化生产,是药剂学研究热点之一。本实验制备吴茱萸碱胃漂浮片,并评价该制剂对家兔胃黏膜损伤的保护作用,以期为相关药物开发提供依据。

1 材料

1.1 仪器 安捷伦1200 型高效液相色谱仪,配置二极管阵列检测器(美国安捷伦公司); PR124ZH型电子天平[奥豪斯仪器(上海) 有限公司];TDP-5 型单冲压片机 (北京海富达科技有限公司); RT612 型溶出仪(深圳锐拓科技有限公司);SK8210HP 型台式超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司); 9240A 型鼓风干燥箱(上海百典仪器设备有限公司); GZX-9070MBE 型电热鼓风干燥机(上海博讯实业有限公司医疗设备厂); BH-2型光学显微镜(日本Olympus 公司)。

1.2 试剂与药物 吴茱萸碱对照品 (批号110802-201925,纯度99.5%,中国食品药品检定研究院); 吴茱萸碱原料药(批号200328,纯度97.0%,湖北帝柏化工有限公司)。西咪替丁胶囊(批号20220219,重庆科瑞制药有限公司)。羟丙甲基纤维素K4M (HPMC K4M,上海卡乐康包衣技术有限公司); 碳酸氢钠(批号202006,上海虹光化工厂); 十六醇(批号191210,西陇科学股份有限公司); 硬脂酸镁(批号WS171008,河南毅硕生物科技有限公司)。

1.3 动物 健康新西兰家兔,雌雄各半,体质量2.0~2.5 kg,购自河南省实验动物中心,实验动物生产许可证号SCXK (豫) 2020-0001。

2 方法与结果

2.1 吴茱萸碱含量测定 采用HPLC 法。

2.1.1 色谱条件 Agilent SB-C18色谱柱(5 μm,200 mm×4.6 mm); 流动相乙腈-0.1%磷酸(含2%四氢呋喃) (40 ∶60); 体积流量1.0 mL/min; 柱温35 ℃; 检测波长225 nm。

2.1.2 供试品溶液制备 取10 片胃漂浮片,研细,精密称取粉末0.3 g (含吴茱萸碱约10 mg),转移至50 mL 量瓶中,加入30 mL 乙腈超声处理10 min,流动相定容,摇匀后8 500 r/min 离心10 min,取上清液1 mL 至50 mL 量瓶中,流动相定容,即得。

2.1.3 线性关系考察 取吴茱萸碱对照品适量,乙腈制成质量浓度为1.0 mg/mL 的贮备液,密封,取适量,流动相稀释至0.05、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/mL,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标 (Y) 进行回归,得方程为Y=23.489 2X+0.136 5 (r=0.999 9),在0.05 ~10.0 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.1.4 方法学考察 取1 片胃漂浮片,按“2.1.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定,测得吴茱萸碱含量RSD 为1.30%,表明该方法重复性良好。取供试品溶液适量,于0、2、4、6、8、12 h 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定,测得吴茱萸碱含量RSD 为0.45%,表明溶液在12 h 内稳定性良好。取低(0.05 μg/mL)、中(1.0 μg/mL)、高(10.0 μg/mL) 质量浓度对照品溶液适量,同一天内在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6 次,测得吴茱萸碱含量 RSD 分别为 0.36%、0.22%,0.24%,表明该方法日内精密度良好; 同法连续测定6 d,每天1 次,测得吴茱萸碱含量RSD 分别为0.63%、0.47%、0.52%,表明该方法日间精密度良好。取10 片胃漂浮片,研细,精密称取9 份,每份约0.15 g (含吴茱萸碱约5 mg),分成3 组,分别加入“2.1.3” 项下贮备液2.5、5.0、7.5 mL,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定,测得吴茱萸碱平均加样回收率分别为101.08%、100.82%、99.40%,RSD 分别为1.04%、0.68%、0.79%。

2.2 释放度测定 采用2020 年版《中国药典》四部0931 通则第二法,设定释放介质为1 000 mL人工胃液(超声处理30 min 脱气),温度为(37±0.5)℃,转速为100 r/min,取样点为1、2、4、6、8、10、12 h,取样体积为3 mL,并补加3 mL空白介质,0.45 μm 微孔滤膜过滤,计算不同时间点累积释放度,绘制释药曲线。

2.3 固体分散体制备及溶解度、释放度测定 取2 g 吴茱萸碱原料药、10 g PVP K30,加入100 mL 无水乙醇,在50 ℃下搅拌3 h,减压旋蒸除去有机溶剂,即得,收集粉末,置于40 ℃真空干燥箱中过夜。

取16.4 mL 稀盐酸至1 000 mL 量瓶中,加800 mL纯化水、10 g 胃蛋白酶,超声溶解,调节pH 至1.3 左右,纯化水定容,即得人工胃液,采用饱和溶剂测得吴茱萸碱及其固体分散体溶解度分别为4.03、68.72 μg/mL,即后者增加了17.05倍。取吴茱萸碱、物理混合物(吴茱萸碱、PVP K30 用量比例1 ∶5)、吴茱萸碱固体分散体粉末适量,5 mL 人工胃液制成混悬液,置于透析袋(截留分子量35 000 Da) 中,扎紧,按“2.2” 项下方法测定累积溶出度,结果见图1,可知固体分散体能促进原料药溶出度。

图1 吴茱萸碱体外溶出曲线(n=3)Fig.1 In vitro dissolution curves for evodiamine (n=3)

2.4 胃漂浮片制备 采用粉末直接压片法[14-16],固定吴茱萸碱用量10 mg/片 (固体分散体中约60 mg/片),取HPMC K15M、十六醇、碳酸氢钠、填充剂(乳糖) 适量,过100 目筛,通过等量递加法混匀,加入1%硬脂酸镁后再混匀,在单冲压片机上压制成直径为8 mm,片重约为0.3 g,即得,硬度控制在(45±5) N。

2.5 漂浮性能测定 设定介质为1 000 mL 人工胃液(超声处理30 min 脱气),温度为 (37 ±0.5)℃,转速为100 r/min,以胃漂浮片从接触介质到稳定漂浮在液面的时间为浮动滞后时间,从开始漂浮到下沉的时间为漂浮时间。

2.6 处方优化 采用Box-Behnken 响应面法。

课题组前期以浮动滞后时间、漂浮时间为评价指标,对HPMC K15M 用量、十六醇用量、碳酸氢钠用量进行筛选,发现三者分别在20% ~36%、4% ~10%、8% ~16% 时可满足浮动滞后时间小于60 s、漂浮时间大于12 h 的要求,但它们对胃漂浮片体外释药有较大影响。因此,本实验以HPMC K15M 用量(X1)、十六醇用量(X2)、碳酸氢钠用量(X3) 为影响因素,2、6、12 h 内累积释放度(Q2h、Q6h、Q12h) 的综合评分Q为评价指标,公式为Q=|Q2h-25%|×100+|Q6h-55%|×100+|Q12h-90%|×100,因素水平见表1,结果见表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

对表2 数据进行二次多元回归拟合,得方程为Q=3.80+7.13X1+2.54X2-12.79X3+3.07X1X2-6.23X1X3-4.50X2X3+7.35X21+9.87X22+13.77X23,方差分析见表3。由此可知,模型P<0.01,具有高度显著性; 失拟度P>0.05,R2=0.961 8,AdjR2=0.912 7,表明模型可用于处方优化,未知因素干扰很小; 因素X2、X3、X1X3、X21、X22、X23 均有显著或极显著影响(P<0.05,P<0.01)。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

采用Design Expert V8.0.6 软件进行响应面分析,结果见图2。设置综合评分目标值为最小,得到最优处方为HPMC K15M 用量25.44%,十六醇用量7.03%,碳酸氢钠用量13.57%,综合评分为0.7 分,为了便于实际操作,将其调整为HPMC K15M 用量25.5%,十六醇用量7.0%,碳酸氢钠用量13.6%。

图2 各因素响应面图Fig.2 Response surface plots for various factors

2.7 验证试验 固定吴茱萸碱用量10 mg/片,HPMC K15M 用量25.5%,十六醇用量7.0%,碳酸氢钠用量13.6%,乳糖补充片重至0.3 g,混匀后加入1%硬脂酸镁,再次混匀后压制3 批样品,按“2.5” 项下方法测得平均浮动滞后时间为76 s,平均漂浮时间达12 h,12 h 内累积释放度均大于90% (图3),综合评分为1.6 分,可知该工艺重复性良好,模型精确可靠。再按2020 年版《中国药典》 四部通则测得胃漂浮片平均硬度为47 N,脆碎度检查显示片剂减失量为0.73%,重量差异为3.66%。

图3 吴茱萸碱体外释药曲线(n=6)Fig.3 In vitro drug release curves for evodiamine (n=6)

2.8 胃黏膜损伤保护作用研究

2.8.1 分组、给药与造模 家兔适应性饲养1 周后随机分为5 组,即正常组、模型组、吴茱萸碱胃漂浮片低剂量组(20 mg/kg)、吴茱萸碱胃漂浮片高剂量组(40 mg/kg)、西咪替丁组(20 mg/kg),每组6 只,雌雄兼具,其中正常组、模型组灌胃给予生理盐水,给药组灌胃给予相应药物,连续13 d,正常进食饮水,观察其活动、精神状态。给药13 d 后,各组家兔禁食不禁水,除正常组外灌胃给予5.0 mL 无水乙醇以建立急性胃黏膜损伤模型,1.5 h 后空气栓塞法处死,取出胃组织。

2.8.2 胃组织病理变化观察 生理盐水洗去家兔胃组织内容物,平铺于玻璃板上,棉球清理胃黏膜表面血丝,切取约1 cm×1 cm,置于10%中性福尔马林溶液中24 h,乙醇脱水后二甲苯透明,石蜡包埋,HE 染色,在显微镜下观察其病理变化,结果见图4。由此可知,正常组黏液层结构未缺失,腺体顶部圆润完好,组织细胞排列致密,未见炎性细胞浸润、水肿、充血等(图4A); 模型组黏液层消失,受损严重,组织细胞排列紊乱(图4B); 吴茱萸碱胃漂浮片低剂量组受损情况明显低于模型组,组织细胞排列相对致密,腺体顶部仍圆润完好,但有出血现象,胃黏膜缺失(图4C); 吴茱萸碱胃漂浮片高剂量组、西咪替丁组无出血现象,黏液层仍清晰可见,但部分区域变薄,腺体结构完整,排列整齐(图4D~4E)。

图4 各组家兔胃组织病理变化(×200)Fig.4 Pathological changes of rabbit gastric tissue in various groups (×200)

2.8.3 行为特征观察 正常组家兔饮食正常,行动灵活,精神状态良好; 模型组家兔喜扎推,活动量明显减少,精神萎靡,反应迟钝,四肢有抖动现象; 吴茱萸碱胃漂浮片低剂量组家兔有1 只出现粪便溏稀现象,精神状态尚可; 吴茱萸碱胃漂浮片高剂量组、西咪替丁组家兔整体情况基本类似,精神状态、活动量均明显好于模型组。

2.8.4 溃疡抑制率测定 采用游标卡尺测量家兔胃内部溃疡长度、宽度,其中前者为溃疡部位的最大直径d1,后者为与最大直径垂直的最宽距离d2,计算溃疡面积S,公式为S=π×d1/2×d2/2。再根据文献[17] 报道计算胃黏膜损伤指数,溃疡面积1~12 mm2为1 分,13 ~25 mm2为2 分,26 ~37 mm2为3 分,38 ~50 mm2为4 分,大于51 mm2为5 分,穿孔为6 分。最后再计算胃溃疡抑制率,公式为抑制率= [(模型组胃溃疡指数-给药组胃溃疡指数) /模型组胃溃疡指数] ×100%,结果见表4,可知高剂量胃漂浮片可达到与西咪替丁类似的保护作用。

表4 溃疡抑制率测定结果(±s,n=6)Tab.4 Results of ulcer inhibition rate determination (±s,n=6)

表4 溃疡抑制率测定结果(±s,n=6)Tab.4 Results of ulcer inhibition rate determination (±s,n=6)

组别剂量/(mg·kg-1)胃黏膜损伤指数溃疡抑制率/%模型组—5.02±0.75—吴茱萸碱胃漂浮片低剂量组202.84±0.6243.43吴茱萸碱胃漂浮片高剂量组402.08±0.4058.56西咪替丁组201.89±0.3562.35

3 讨论

吴茱萸碱胃漂浮片与水相接触后体积发生膨胀,导致其密度下降,从而有助于实现漂浮,并且加入十六醇、碳酸氢钠的目的也是减小片剂密度[18],提高漂浮性能。虽然十六醇用量在一定程度上会影响片剂释药情况[19],但碳酸氢钠用量对释药的影响比十六醇用量大,这是因为前者用量合适时可有效消除片剂延迟释放、提高Q6h、Q12h,但用量过大时生成的CO2包裹在片剂表面,反而阻碍介质渗入内部。本实验进行吴茱萸碱胃漂浮片处方优化时,将Q2h、Q6h、Q12h转换为综合评分,期望Q2h释放度能达25%,防止出现迟释情况;Q6h释放度能在55% 左右,防止出现过释情况;Q12h释放度能达90%,防止出现释药不足情况,最终获得了漂浮性能良好、缓慢持续释药、累积释放度较高的处方。

按照家兔与成人(体质量按60 kg 计) 剂量之间的比例系数(3 ~4),结合本实验所制备的吴茱萸碱胃漂浮片剂量(10 mg/片,整片给药),最终确定家兔每日口服西咪替丁剂量为20 mg/kg[20],并设置了低剂量组(20 mg/kg)、高剂量组(40 mg/kg) 进行比较。前期报道,吴茱萸碱给药剂量为2.68 g/kg 时动物未发生毒性反应,因此高剂量组灌胃40 mg/kg 时具有较高的安全性[21]。结果显示,吴茱萸碱胃漂浮片对家兔胃黏膜损伤具有一定预防性保护作用,但需加大给药剂量才能达到与西咪替丁相似的效果。对于茱萸和胃止痛胶囊、左金胶囊等临床上治疗胃病的常用中成药,吴茱萸碱、吴茱萸次碱每天口服总剂量在2.7 ~19.1 mg 之间[22-23],故确定吴茱萸碱胃漂浮片含药量为10 mg/片。今后,需结合毒理学实验来确定吴茱萸碱胃漂浮片给药方案,并且其不同规格的相关情况也是研究重点。

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