续断种子方对少弱精子症大鼠附睾精子成熟的干预作用及其机理研究❋

黄子彦,张亚光,陈豪特,王权胜△

(1.广西中医药大学第一临床医学院,南宁 530001;2.广西中医药大学第一附属医院,南宁 530023;3.广西中医药防治医学分子生物重点实验室,南宁 530023;4.杭州市中医院,杭州 310007)

少弱精子症是导致男性不育的重要原因之一,中医药治疗少弱精子症存在优势[1-2],而续断种子方对于少弱精子症存在治疗效果,其在临床研究与基础研究方面有着一定前期基础[3-5]。2021年第6版《世界卫生组织人类精液检测与处理实验室手册》精子总数与前向运动精子两项较第5版数值略有降低[6],提示人类精子质量存在逐步下降的可能性。精子的发生发育过程具有程序化的特征,即“精原细胞-精母细胞-精子细胞-精子”的生长发育与减数分裂的链式过程,在此过程中精子产生于睾丸,成熟于附睾[7],附睾尾部和精液中精子的形态、结构与功能的完整性存在差异,这一过程中的各个时间空间节点异常都有可能影响精子的数量与活动力[8],如精索静脉曲张、男性生殖系感染、糖尿病与慢性肝炎等全身性疾病、抗精子抗体、单核苷酸多态性、基因变异等[9-10],而在附睾部分主要与附睾分泌蛋白、附睾内细胞因子等附睾微环境因素有关。酪氨酸蛋白激酶2/信号传导及转录激活因子3(Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3,JAK2/STAT3)信号通路广泛参与细胞应激、增殖、分化和凋亡等多种生物效应,与精子形态功能关系密切[11]。本研究通过建立实验性大鼠少弱精子症模型,尝试从JAK2/STAT3通路基于附睾管局部显微、超微结构研究续断种子方对少弱精子症模型大鼠附睾微环境的作用,续断种子方干预少弱精子症的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

48只雄性SD大鼠,6～8周龄,体质量200～220 g(湖南斯莱克景达实验动物有限公司,SCXK(湘)2019-0014)。饲养于广西中医药防治医学分子生物重点实验室动物房,温度19～25 ℃,湿度55%～65%,每日光照10～12 h,自由进食饮水,3 d更换一次笼中玉米芯垫料。

1.2 主要试剂与仪器

JAK2抗体、STAT3抗体购自美国CST公司,货号分别为3230、9139;WLJY-9000型精子质量检测系统,北京伟力新世纪科技发展有限公司;Finesse E型半自动轮转切片机,美国Thermo Fisher公司;EG1150H+C型石蜡包埋机,德国Leica公司;BX43型倒置相差显微镜,日本Olympus公司;JY-ZY3型半干式转移电泳槽,济南君意生物科技有限公司;5200 Multi型全自动化学发光/荧光图像分析系统,上海天能科技有限公司;XH-C型涡旋混合器,江苏荣华实验器材有限公司;Epoch型酶标仪,美国BioTek公司;DYCZ-25E型电泳仪,北京六一生物科技有限公司;5430 R型台式冷冻离心机,德国Eppendrof公司;Tecnai G220型透射电子显微镜,美国FEI公司。

1.3 制备药物

续断种子方颗粒剂(主要药物组成:菟丝子10 g、杜仲10 g、续断10 g、骨碎补10 g、女贞子10 g、枸杞子10 g、党参10 g、白术10 g、山药10 g),剂型采用天江药业免煎颗粒(江阴天江药业有限公司,药品许可证号:1203002);左卡尼汀口服溶液(东北制药总厂,国药准字H19990372,规格:10 mL);注射用环磷酰胺(德国Baxter公司,进口药品注册证号:H20160467,规格:0.2 g)。

1.4 分组与制作动物模型

适应性饲养1周,在此过程中每日观察大鼠进食、饮水、活动是否正常,然后制作动物模型,按照随机数字表法将48只大鼠随机分为模型组、续断种子方组、左卡尼汀组、空白组,每组12只。除空白对照组大鼠外,其他组大鼠均采用 80 mg/kg/d环磷酰胺以0.9%氯化钠溶液稀释后连续7 d腹腔注射造模[12],造模完成后通过精子质量检测造模是否成功。

1.5 给药

造模第8天开始给药,模型组大鼠每天给予0.9%氯化钠溶液4 mL灌胃;续断种子方组予续断种子方配方颗粒10 g/kg/d溶于0.9%氯化钠溶液灌胃,左卡尼汀组予左卡尼汀口服溶液100 mg/kg/d溶于0.9%氯化钠溶液灌胃;持续8周。

1.6 观察与检测

1.6.1 精子质量检测 末次给药后断颈处死大鼠,摘取各组大鼠附睾组织,冲洗、剪碎、浸泡,参考WHO《人类精液检查与处理实验室手册》标准测定精子参数[6]。

1.6.2 大鼠附睾组织显微及超微结构观察 取大鼠附睾组织,固定、包埋、切片机连续切片,脱蜡后进行HE染色,封片后光学显微镜观察并拍照,光镜下观察各组附睾组织常规病理变化,包括结构完整性、附睾上皮、生精细胞、精子、附睾间质等。取2 mm3附睾组织,加入2.5%戊二醛,在4 ℃保存,经固定、渗透,后将标本放入包埋板中固定48 h,超薄切片机切片,厚度80～100 nm,铀铅双染色标本,最后用电镜观察。电镜下观察各组附睾组织超微结构变化,如细胞核、染色质、溶酶体、核仁、线粒体等。

1.6.3 Western blot检测JAK2和STAT3蛋白表达 将附睾组织用研磨仪研磨粉碎,加入蛋白裂解液,充分裂解,重复5次;4 ℃ 10 000 g离心10 min,取上清液,加蛋白上样缓冲液,煮沸10 min,使用10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel,SDS-PAGE) ,电泳、分离蛋白,然后修剪,根据胶的大小剪好吸水纸和聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,并放入转膜液中浸泡,放入电转槽中转膜,再用5%脱脂牛奶摇床上孵育45 min,取出封闭过后的膜震荡洗涤,加入JAK2(1:1 000)、STAT3(1:1 000)一抗4 ℃孵育过夜,放入缓冲液中震荡洗涤,再加入二抗孵育1 h,用TBST缓冲液洗膜,显色后在成像系统进行曝光成像,应用Image J软件对蛋白条带进行分析。

1.6.4 免疫组化检测JAK2和STAT3蛋白表达 取附睾组织石蜡切片5 μm,滴加3%的过氧化氢,5%牛血清白蛋白溶液封闭后,分别加JAK2(1:200)、STAT3(1:200)一抗,4 ℃恒温过夜、磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗后,滴加二抗,然后显色、复染,脱水封片后镜检并拍照,阳性细胞染成棕黄色,使用Image J软件分析目标蛋白平均光密度值。

2 结果

2.1 一般情况

造模后的3组大鼠均出现不同程度的进食和饮水减少,精神不振,毛发光泽度降低、干枯掉落,活动减弱等表现;空白组大鼠外观、饮食与活动情况未见明显异常。在给药期间部分大鼠脱落,原因可能与环磷酰胺毒性或捕捉灌胃应激反应有关。

2.2 续断种子方对模型大鼠精子浓度及总活动力的影响

与空白组大鼠比较,模型组大鼠的精子浓度与总活动力明显下降(P<0.01);与模型组大鼠比较,续断种子方组大鼠的精子浓度与总活动力明显上升(P<0.01);与左卡尼汀组大鼠比较,续断种子方组大鼠的精子浓度与总活动力上升(P<0.05),见表1。

表1 各组大鼠附睾精子浓度及总活动力

2.3 续断种子方对大鼠附睾物理支持结构的影响

光镜下,模型组大鼠附睾结构完整性可见明显破坏,病理改变呈区段性。上皮细胞数量较少,管腔中存在非精子成分,精子浓度较低且分布不均匀,附睾间质内结构出现缺损,见图1A。续断种子方组大鼠附睾各区段结构相对完整,细胞排列整齐,附睾间质稍见水肿,部分巨噬细胞与淋巴细胞浸润,管腔内刷状缘形态基本正常,含大量成熟精子,与少量畸形、不成熟精子,见图1B。左卡尼汀组大鼠附睾上皮完整度较模型组高,细胞排列整齐,偶可见上皮退化、变形,精子浓度较模型组高,有部分畸形精子存在,附睾间质轻度水肿,微小血管扩张,见图1C。空白组大鼠附睾组织结构完整,刷状缘形态正常,附睾上皮细胞层次清晰,排列整齐有序,管腔内精子密集,见图1D。

电镜下,模型组大鼠附睾上皮细胞排列紊乱松散,可见主要为单层排列,游离面微绒毛大幅度减少,部分细胞呈空泡样变性。细胞核较小、畸形或呈固缩状态,核膜褶皱,核内染色质分散,核仁未窥及,可见细胞质中的线粒体肿胀且数量明显少于空白组,部分上皮细胞甚至出现空泡样变。附睾管腔面可见脱落胞质,管腔内多为不成熟、畸形精子,见图2A。续断种子方组大鼠附睾上皮细胞超微结构与空白组大鼠相近,细胞排列较整齐致密且形态结构完整,游离面微绒毛较模型组丰富,部分细胞空泡化程度较模型组轻。细胞核多位于基底部,大小适中,核内染色质均匀分布,核仁明显,核膜出现部分皱折,局部偶有内陷,细胞质内细胞器结构相对完整,圆形线粒体、溶酶体较丰富,高尔基体较模型组多。附睾管腔内虽可见小部分畸形精子,但结构正常的成熟精子占多数,见图2B。左卡尼汀组大鼠附睾上皮细胞排列整齐,游离面微绒毛较模型组明显丰富。细胞核细胞质中粗面内质网结构相对完整,线粒体数量较多,层次分明。相较于模型组大鼠,空泡样改变的细胞较少且附睾管腔内结构正常的精子较多,见图2C。空白组大鼠附睾上皮细胞结构完整且边缘清楚,可见正常形态结构的细胞,排列整齐严密有序,细胞核较大,基膜连续完整,核仁清晰明显,核内染色质分布均匀,附睾管管腔中成熟精子大量存在,见图2D。

2.4 Western blot检测JAK2和STAT3蛋白表达

各组大鼠Western blot检测分析结果显示,与空白组大鼠比较,模型组大鼠JAK2、STAT3在附睾组织中的表达水平明显下降(P<0.01);与模型组大鼠比较,续断种子方组大鼠JAK2、STAT3在附睾组织中的表达水平明显上升(P<0.01),左卡尼汀组大鼠JAK2表达明显上升(P<0.01),STAT3表达上升(P<0.05),见图3。

注:与模型组比较*P<0.05,**P<0.01;与左卡尼汀组比较##P<0.01;酪氨酸蛋白激酶2(JAK2),信号传导及转录激活因子3(STAT3)A.模型组;B.续断种子方组;C.左卡尼汀组;D.空白组

A.模型组;B.续断种子方组;C.左卡尼汀组;D.空白组

A.模型组;B.续断种子方组;C.左卡尼汀组;D.空白组

2.5 免疫组化法检测JAK2与STAT3表达

如图4所示,模型组大鼠JAK2蛋白棕黄色阳性表达低见图4A;续断种子方组大鼠见图4B与左卡尼汀组大鼠见图4C的JAK2蛋白棕黄色阳性表达较模型组高;空白组大鼠JAK2蛋白棕黄色阳性表达最高,见图4D。

如图5所示,模型组大鼠STAT3免疫组化棕黄色阳性表达低,见图5A;与模型组大鼠比较,续断种子方组大鼠(图5B)与左卡尼汀组大鼠(图5C)附睾的STAT3棕黄色阳性表达更高;空白组大鼠STAT3免疫组化中棕黄色阳性表达最高(图5D)。另外,STAT3蛋白在模型大鼠附睾中的精子头部表达相对丰富。

如图6所示,与空白组大鼠比较,模型组大鼠JAK2、STAT3表达明显下降(P<0.01);与模型组大鼠比较,续断种子方组大鼠和左卡尼汀组大鼠JAK2、STAT3表达明显上升(P<0.01)。

注:与模型组比较**P<0.01;与左卡尼汀组比较##P<0.01;酪氨酸蛋白激酶2(JAK2),信号传导及转录激活因子3(STAT3)A.模型组;B.续断种子方组;C.左卡尼汀组;D.空白组

3 讨论

JAK2/STAT3通路能介导来自多种细胞因子的信号转导,在多种致病因素的侵袭导致相关细胞因子的释放和疾病的进展中发挥重要作用,参与调控细胞的增殖凋亡过程[13-15],亦是各种理化因素诱导的广泛的组织细胞损伤及相应病理改变的机制之一[16-18],与细胞的各种生理和病理功能有关,其关键蛋白在精子中与激活核转录、精卵识别与精子活动相关。精子活动能源在于线粒体,在精子中,STAT3主要富集于头部与鞭毛部位,STAT3受抑制后,线粒体膜去极化上升,伴随ROS与ATP水平的变化与精子活动力的下降。因此氧化损伤与细胞凋亡相关的附睾输出小管上皮结构完整性与内环境受破坏,分泌功能失调,JAK2/STAT3信号通路的抑制,精子数量减少,活动力下降,可能是少弱精子症的发病机制之一。附睾是精子发育成熟的重要场所,精子在附睾中成熟过程的分子机制与参与免疫反应、细胞运动、精子成熟、精子储存和获能的某些RNA有关[19],附睾中的特异性蛋白质在精子发育中起着至关重要的作用,如直接参与附睾中精子的成熟、获能、顶体反应与精卵结合,与管腔液其他成分形成动态平衡的附睾微环境,以及免疫保护、抗菌、抗氧化等作用[20]。环磷酰胺、热刺激、奥硝唑等各种造模方式导致大鼠睾丸和附睾物理支持结构的破坏与精子发生发育的时空节点受到干扰,进而使得生殖机能出现缺陷[21]。附睾头部有自己的组织学特征和明确的同质化基因表达模式,专门用于防御和免疫反应以及受精,远端体和附睾尾部因数量有限的差异表达基因而不同。附睾这种显著的区域性物理支持结构具有相当的空间特征,与精子在附睾中发育成熟处于不同时间段的时间特征共同构成了附睾结构与功能时空节点相关的微环境。

通过本次实验我们发现大鼠附睾显微超微结构的病理改变与精子浓度、活动力可能存在密切联系。一方面环磷酰胺给药能导致模型大鼠导致丙二醛、亚硝酸盐和过氧化氢水平显著升高,超氧化物歧化酶和谷胱甘肽-S-转移酶的活性显著降低。此外,血浆促黄体生成素、卵泡刺激素和睾酮水平降低[22];另一方面,附睾区段性上皮退化变性,同一层面的细胞发育不同步,附睾管柱状上皮细胞退行性改变,基底部胞质空泡化,各级细胞排列紊乱甚至脱落,部分主细胞、基细胞空泡样变,附睾管壁结构完整性被破坏,附睾管腔中精子数目明显减少,非精子细胞成分增加,附睾间质水肿,精子尾部线粒体鞘部分缺失,线粒体溢出,内部结构崩解碎裂导致附睾内分泌功能和附睾管腔内液的成分改变,直至微环境的稳态被破坏从而影响精子发生发育。

本研究以模型大鼠为研究对象,采用补肾健脾益气的方法进行治疗,续断种子方这一中药方剂的组方思路源自中医学经典著作《医学正印》里的补肾健脾益气种子煎方,基于“种子土壤学说”的理论且谨守少弱精子症“营气不从”的机制遣药组方,方中续断、杜仲、菟丝子行少阴益肾温补填其先天之精,山药、党参、白术和缓甘平,走太阴健脾养其后天水谷之精,骨碎补、枸杞子佐助续断强肾益阳之效,女贞子系方中阳中之阴,阴阳并补则生精有源。本实验研究结果表明:各组大鼠附睾组织中均有JAK2蛋白和STAT3蛋白的表达,模型组大鼠JAK2蛋白和STAT3蛋白的表达量低于其他3组大鼠,提示少弱精子症的发生机制可能与附睾JAK2/STAT3信号通路受抑制有关,续断种子方有可能通过活化JAK2/STAT3信号通路培育附睾精子发育成熟的微环境,有利于精子结构的塑造和获能。这与本方“精气互用”改善人体的虚劳状态的中医药理论基本一致[23],为中医辨证论治少弱精子症提高其精子质量与配偶妊娠率提供可行的治疗途径。

综上所述,续断种子方可能通过调节JAK2/STAT3信号通路维护模型大鼠附睾组织结构的稳定性,培育附睾精子发育成熟的微环境,有利于精子结构的塑造和获能。