基于Wnt/β-catenin通路探讨当归补血汤防治化疗后骨髓造血细胞衰老的机制❋

白 莹,刘俊岑,王佳佳,贾富霞,王文娟

(首都医科大学中医药学院,北京 100069)

化疗是中晚期恶性肿瘤患者常用的治疗手段,骨髓抑制是化疗药最常见的不良反应,主要表现为骨髓造血能力下降,外周血细胞或其产物数量低于正常参考值[1]。骨髓抑制分为急性骨髓抑制和潜在骨髓损伤两种类型[2]。急性骨髓抑制在接受化疗后很快发生,主要是快速增殖的造血祖细胞凋亡所致,临床上表现为成熟造血细胞的数量明显降低,应用造血生长因子可以促进骨髓造血恢复; 潜在骨髓损伤发生于急性骨髓抑制之后,主要是由于化疗药物诱导造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)发生衰老,损伤其自我更新能力,进一步导致HSCs储备减少,最终恶化为发育不良和骨髓增生异常综合征。由于其迟发性,在临床上容易被忽视,故临床预后很差。目前治疗急性骨髓抑制的方法有升白细胞药、造血因子、成分输血等[3],而对潜在骨髓损伤则缺乏有效防治措施。

骨髓抑制属于中医“虚劳”“血虚”等范畴[4]。中医认为化疗药属药毒之邪,进入人体后可损伤正气,耗伤精血,因此气血亏虚是骨髓抑制的基本病机。临床治疗骨髓抑制均以补气养血为基本治法,常采用当归补血汤(Danggui Buxue Decoction,DBD)加味[5]。相关研究发现,DBD对化疗后骨髓造血细胞增殖和凋亡有较好的调节作用[6]。骨髓造血细胞增殖和凋亡与化疗后骨髓造血细胞衰老密切相关,本研究计划在前期结果基础上,观察DBD对化疗后骨髓造血细胞衰老及相关Wnt/β-catenin通路[7-11]的影响,为临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 动物

SPF级6～8周龄雄性BALB/c小鼠60只,体质量(20±2)g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司[生产许可证号:SCXK(京)2016-0011]。动物饲养于首都医科大学实验动物中心,饲养于宽敞通风的清洁级动物房,温度20～25 ℃,湿度40%～70%,噪声<60分贝,照明时间L/D =12 h/12 h,所有实验动物开始实验之前先适应性饲养一周自由饮食。所有动物实验均经首都医科大学动物伦理委员会批准[伦理编号:AEEI-2018-054]。

1.2 药品与试剂

DBD:当归6 g、黄芪30 g,采用中药配方颗粒剂购自北京康仁堂药业有限公司,批号:当归21003261,生黄芪21005751,规格:每袋7 g;环磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)购自江苏盛迪医药有限公司,批号:18020825,规格:0.2 g/支,10支/盒;重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulating factor, rhG-CSF)购自厦门特宝生物工程股份有限公司,批号:202105B06,规格:75 μg/瓶;小鼠β-半乳糖苷酶(SA-β-galactosidase, SA-β-Gal)酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒购自北京美辰联创生物科技有限公司,货号:MC17266;无水乙醇购自国药集团化学试剂有限公司,批号:100092183;p53 (1C12)一抗,GSK-3β (D5C5Z)一抗,β-Catenin (D10A8)一抗购自美国CST公司,货号:2524,12456,8480;p21 Cip1一抗,购自上海爱必信生物科技有限公司,货号:abs131808;放射免疫沉淀法缓冲液,radioimmunoprecipitation assay buffer,RIPA)裂解液、蛋白磷酸酶抑制剂混合物购自北京普利莱基因技术有限公司,批号:202107258620,202106182221;总RNA提取试剂盒,反转录试剂盒购自北京天根生化科技有限公司,货号:DP419,KR116-02;实时荧光定量聚合酶链式反应(real time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)试剂盒购自北京兰博利德生物技术有限公司,货号:R0202。

1.3 仪器

血常规生化仪,型号K4500,日本希森美康公司;低温冷冻离心机,型号3K15,美国Sigma公司;酶标检测仪,型号ST-360,上海科华生物工程股份有限公司;脱水机,型号Donatello,意大利DIAPATH公司;包埋机,型号JB-L5,武汉俊杰电子有限公司;病理切片机,型号RM2016,上海徕卡仪器有限公司;电泳仪、电泳槽、电转仪,型号分别为164-5050、165-6001和170-3930,美国Bio-Rad公司;RT-qPCR仪,型号CFX96,美国Bio-Rad公司;凝胶、化学发光成像分析系统,型号LAS3000,日本Fujifilm公司。

2 方法

2.1 分组、造模和干预

将小鼠按随机数字表法分为空白对照组,模型对照组,阳性对照组,DBD高、中、低剂量组,每组10只。本次DBD组共连续给药10 d,先预防给药5 d,空白对照组、模型对照组、阳性对照组灌胃蒸馏水,DBD高、中、低剂量组分别按24 g/kg、12 g/kg、6 g/kg灌胃相应中药(低剂量相当于临床等效剂量)。第6天除空白对照组腹腔注射0.9%氯化钠溶液外,其余组按100 mg/kg腹腔注射CTX,每日1次,连续造模3 d。造模期间开始干预用药,阳性对照组按30 μg/kg皮下注射rhG-CSF,其他组按照预防给药期间的给药方案每日给药1次,连续5 d。第11天取材。

2.2 血常规检测

小鼠眼眶取EDTA-K2抗凝血50 μL,全自动血细胞分析仪检测外周血常规。

2.3 器官指数计算

颈椎脱臼处死小鼠,取肝、脾、胸腺,称重。计算器官指数(器官指数=器官重量/小鼠体质量)。

2.4 ELISA检测骨髓造血细胞SA-β-Gal含量

取小鼠双侧股骨,反复冲洗骨髓腔,收集骨髓造血细胞。取部分骨髓造血细胞,提取总蛋白,定量后,采用SA-β-Gal ELISA试剂盒检测,标准品孔和样本孔中加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的检测抗体100 μL,封板膜封闭后37 ℃恒温箱中孵育60 min。洗板后,每孔加入底物A,B,37 ℃避光孵育15 min后,15 min之内,于450 nm处测定OD值。绘制标准曲线,计算样本SA-β-Gal含量。

2.5 髂骨造血组织苏木精-伊红(hematoxylin-eosinstaining, HE)染色

取小鼠右侧髂骨,10%中性福尔马林固定,进行骨组织脱钙、石蜡包埋,采用切片机切片(最大面切开),HE染色,光镜下拍片。

2.6 Western blot检测骨髓造血细胞p21、p53、GSK-3β、β-catenin蛋白表达

取骨髓造血细胞,加入RIPA提取蛋白,定量煮沸,蛋白样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),转至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,加入含5%脱脂奶粉的TBST 溶液封闭2 h,分别加入p21、p53、GSK-3β、β-catenin抗体(1:1 000)和内参β-actin 抗体(1:2 000),4 ℃孵育过夜;含吐温的Tris-HCl缓冲盐溶液(Tris Buffered Saline with tween, TBST)洗涤3次,10 min/次。加入HRP标记的二抗(1:5 000)室温孵育1 h,洗膜,ECL显影。采用Image J软件进行条带灰度值分析,以β-actin为内参计算p21、p53、GSK-3β、β-catenin蛋白表达。

2.7 RT-qPCR检测骨髓造血细胞p21、p53、GSK-3β、β-catenin及c-myc mRNA表达

取骨髓造血细胞,按照试剂盒说明书提取总RNA,合成cDNA,进行RT-qPCR。反应体系20 μL,反应条件:95 ℃预变性30 s,95 ℃变性10 s、60 ℃退火延伸30 s,40个循环。引物序列见表1。以β-actin为内参,采用2-△△Ct法分析p21、p53、GSK-3β、β-catenin及c-myc mRNA相对表达。

表1 引物序列

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 DBD对小鼠体质量的影响

如图1所示,造模后与空白对照组相比较,模型对照组小鼠体质量呈现下降趋势,差异具有统计学意义(P<0.05)。

注:与空白对照组相比较▲▲P<0.01;Blank.空白对照组;Model.模型对照组;Positive.阳性对照组;DBD L.DBD低剂量组;DBD M.DBD中剂量组;DBD H.DBD高剂量组

3.2 DBD对外周血参数的影响

如图2所示,与空白对照组相比较,模型对照组白细胞(white blood cell,WBC)数、中性粒细胞(neutrophil,NETU)数、淋巴细胞(lymphocyte,LYMPH)数均显著降低(P<0.05)。与模型对照组相比较,DBD高剂量组WBC数显著升高(P<0.05)。外周血红细胞(red blood cell,RBC)数、血小板(platelet,PLT)数、血红蛋白(haemoglobin,HGB)浓度各组均无明显差异(P>0.05)。

注:与空白对照组相比较▲P<0.05,▲▲P<0.01;与模型对照组相比较★P<0.05;与阳性对照组相比较#P<0.05,##P<0.01;白细胞 (WBC);中性粒细胞 (NETU);淋巴细胞 (LYMPH);红细胞 (RBC);血小板 (PLT);血红蛋白 (HGB) ;Blank.空白对照组;Model.模型对照组;Positive.阳性对照组;DBD L.DBD低剂量组;DBD M.DBD中剂量组;DBD H.DBD高剂量组

3.3 DBD对脾、肝、胸腺器官指数的影响

如图3所示,与空白对照组相比较,模型对照组脾、胸腺器官指数均显著降低(P<0.01),肝器官指数显著升高(P<0.01)。与模型对照组相比较,DBD各剂量组脾器官指数均显著升高(P<0.05),肝器官指数均显著降低(P<0.05)。

3.4 DBD对骨髓造血细胞SA-β-Gal含量的影响

如图4所示,与空白对照组相比较,模型对照组SA-β-Gal含量显著升高(P<0.01)。与模型对照组相比较,DBD中、高剂量组SA-β-Gal含量均显著降低(P<0.05)。

注:与空白对照组相比较▲▲P<0.01;与模型对照组相比较★P<0.05,★★P<0.01;与阳性对照组相相比较##P<0.01;SA-β-半乳糖苷酶SA-β-galactosidase(SA-β-Gal);Blank.空白对照组;Model.模型对照组;Positive.阳性对照组;DBD L.DBD低剂量组;DBD M.DBD中剂量组;DBD H.DBD高剂量组

3.5 DBD对髂骨造血组织的影响

如图5所示,空白对照组骨髓造血细胞数量多,造血组织结构紧密,无核血细胞几乎不可见;模型对照组骨髓造血细胞数明显减少,造血组织间隙较大,无核血细胞数目增多;与模型对照组相比较,DBD各剂量组、阳性对照组骨髓造血细胞数目均明显增多,造血组织间隙明显减小,无核血细胞数目减小。

注:与空白对照组比较▲P<0.05,▲▲P<0.01;与模型对照组比较★P<0.05,★★P<0.01;黑色箭头是指髂骨中空腔部分,绿色箭头是指骨髓中骨髓造血细胞,红色箭头是指无核血细胞

3.6 DBD对骨髓造血细胞p21、p53、GSK-3β、β-catenin蛋白表达的影响

如图6所示,与空白对照组相比较,模型对照组β-catenin、p53、p21蛋白表达均显著上调(P<0.05)。与模型对照组相比较,DBD高剂量组β-catenin、p53、p21蛋白表达均显著下调(P<0.05);DBD中剂量组β-catenin表达显著下调(P<0.05)。GSK-3β表达各组无明显变化(P>0.05)。

注:与空白对照组比较▲P<0.05,▲▲P<0.01;与模型对照组比较★P<0.05,★★P<0.01;Blank.空白对照组;Model.模型对照组;Positive.阳性对照组;DBD L.DBD低剂量组;DBD M.DBD中剂量组;DBD H.DBD高剂量组A.分子蛋白表达图;B.蛋白表达水平比较图

3.7 DBD对骨髓造血细胞p21、p53、GSK-3β、β-catenin、c-myc mRNA表达的影响

如图7所示,与空白对照组相比较,模型对照组p21、p53、β-catenin、c-myc mRNA表达均显著上调(P<0.05)。与模型对照组相比较,DBD高剂量组p21、p53、β-catenin mRNA表达均显著下调(P<0.05),GSK-3β mRNA表达显著上调(P<0.01);DBD低剂量组β-catenin mRNA表达显著下调(P<0.01),GSK-3β mRNA表达显著上调(P<0.05)。

注:与空白对照组比较▲P<0.05,▲▲P<0.01;与模型对照组比较★P<0.05,★★P<0.01;Blank.空白对照组;Model.模型对照组;Positive.阳性对照组;DBD L.DBD低剂量组;DBD M.DBD中剂量组;DBD H.DBD高剂量组

4 讨论

从中医病因角度来看,化疗药物属于外来的“毒邪”,因此恶性肿瘤患者在接受化疗治疗时,外来的“毒邪”就会侵入机体。从中医角度认为肿瘤患者正气不足,因此毒邪侵入后,机体功能就会受到“毒邪”干扰而发生紊乱,最终严重影响人体气血化生,引起脏腑功能失调。在化疗药诱发的众多不良反应中,以骨髓抑制为主要表现的血液毒性最为常见。骨髓抑制患者临床常见面色苍白、头目眩晕、神疲倦怠、乏力气短、心慌失眠等症状,中医病机主要为气血两虚,临床常采用DBD作为治疗基础方[12]。DBD出自李东垣《内外伤辨惑论》,方中黄芪与当归比为5:1,现代药理研究证明按照这一比例配制出的方剂药效最佳[13]。

依据骨髓抑制的病因病机,治疗上应首先从补气血入手,同时还应调治与气血生成密切相关的脏腑,养先天而助后天,扶正气而生精血,以使气血化生有源。中医认为“气生血”,现代医学研究认为各类血细胞由造血细胞分化增殖而来,中医基础理论中提到的“气”可以认为对于造血细胞具有保护作用。造血细胞衰老是骨髓抑制的主要机制[4, 14]。造血干细胞是机体造血系统中所有血细胞的来源,具有自我更新、多向分化及长期造血重建功能[15]。有研究表明急性白血病化疗后复发小鼠体内造血干细胞的正常造血重建功能受损,而这种损伤可能是因过度增殖诱发的细胞衰老所致[16]。造血干细胞衰老的机制目前仍不明确。现有研究表明其机制包括 DNA 损伤、端粒缩短、活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平升高、表观遗传修饰、细胞极性改变、代谢及造血微环境等几方面[7, 17]。本研究显示,环磷酰胺注射后小鼠外周血WBC、NETU、LYMPH显著下降,脾、胸腺器官指数显著降低,髂骨骨髓中造血细胞数明显减少,造血组织间隙较大,说明化疗药可损伤骨髓造血组织,进而降低机体免疫功能。此外,SA-β-Gal作为细胞衰老标志性的酶类物质,化疗药还明显增加了小鼠骨髓造血细胞中SA-β-Gal含量,p53/p21途径是一条经典的衰老相关途径,上调p53和p21基因及蛋白的表达,提示化疗药可引起骨髓造血细胞衰老,并影响与细胞衰老相关的p53/ p21途径。采用DBD防治后,小鼠外周血WBC显著上升,脾器官指数显著升高,骨髓中造血细胞数明显增加,空腔明显减少,说明DBD可保护骨髓造血组织,提高机体免疫功能。此外,DBD组骨髓造血细胞中衰老相关的SA-β- Gal含量显著降低且与衰老相关p53和p21基因和蛋白的表达降低,此二个指标提示DBD对于防治骨髓造血细胞的衰老发挥了作用。

Wnt/β-catenin 信号通路可以调节造血微环境而引起造血干细胞衰老,并参与干细胞增殖、凋亡等生命过程[8]。β-catenin为Wnt/β-catenin信号通路的核心蛋白[18],GSK-3β蛋白可通过促进β-catenin N端的Ser/Thr磷酸化而使β-catenin降解[19],从而调节β-catenin的细胞内含量。根据相关研究表明:DBD中共有两味中药,其中当归中的当归多糖影响Wnt信号通路上中下游并且当归多糖可以通过Wnt信号通路来延缓衰老模型大鼠造血干细胞的衰老情况[20-21],另一项研究中提出当归多糖可以下调Wnt通路中β-catenin、Wnt 4a、GSK-3β、MMP-13和ADAMTS4的表达[22];黄芪中的黄芪多糖能够通过上调β-catenin基因、下调Axin-1基因的表达影响Wnt通路[23];黄芪甲苷能够上调脑缺血再灌注损伤模型中 Wnt 家族重要蛋白 Wnt3a 及下游β-catenin的表达,同时通过提高BNDF和TCF-4蛋白水平影响HepG-2细胞的增殖和凋亡[24-25];黄芪总黄酮下调强直性脊柱炎模型中Wnt1和β-catenin蛋白的表达[26];黄芪总皂苷通过上调Wnt通路上游蛋白 Wnt3/3a和枢纽蛋白 β- catenin ,上调下游促分化靶向蛋白 Ngn1的表达影响Wnt通路[27]。研究DBD对于β-catenin蛋白的影响是研究Wnt通路的关键,本次研究中β- catenin蛋白模型对照组表达明显上升说明此模型中Wnt通路被激活,DBD高剂量组的β- catenin基因和蛋白表达下调以及GSK-3βmRNA表达上调都提示该剂量的DBD对于此通路起到了抑制作用。

综上所述,本次研究说明DBD对于防治化疗后骨髓造血细胞的衰老有明显的作用,为探究DBD防治化疗后骨髓造血细胞衰老的机制提供了研究结果和思路,其中DBD高剂量组的药效结果最好。提示临床上对于需要放化疗的患者可以提前服用并适当增加DBD的剂量以保护骨髓造血细胞,对于放化疗后引起的骨髓抑制贫血的副作用进行预防。