成株抗性与全生育期抗性基因聚合培育抗条锈性小麦新品种

白斌 杜久元 何瑞 杜晓霖 郭莹

关键词：小麦；条锈病；基因聚合；分子标记；兰天132；兰天196

小麦条锈病（wheat stripe rust）是危害我国北方小麦安全生产的重要病害之一。西北麥区又是我国小麦条锈菌最重要的菌源越夏区和小种易变区，尤其甘肃陇南地区（天水市、陇南市）因其地理环境特殊，成为我国小麦条锈菌核心越夏区和小种易变区。近年来，由于暖冬等气候变化，小麦条锈病在我国西北、黄淮冬麦区的流行呈偏重发生，并向长江中下游麦区等地扩展。据国家统计局数据，2021年全国小麦条锈病发生面积446.3万hm2，占全国小麦面积的19.48%，是自2017年以来发病最重的一年。

利用抗病基因培育抗病品种是长期有效防控条锈病的重要方法。迄今为止，正式命名的小麦抗条锈病基因已有80多个（Yr1～Yr83），另外还有一些暂未正式命名的抗病基因，如YrZH22．YrZH84和YrZM103等。抗病基因按类别分为全生育期抗性基因和成株期抗性基因，全生育期抗病基因如Yr5，Yr9，Yrl0，Yr15，Yr17，YrZH22和YrZH84等，成株期抗病基因如Yr18，Yr29，Yr30，Yr36和Yr46等。但由于小麦条锈菌致病小种的不断变异和育种中偏好全生肓期抗性基因的利用，已导致多个全生育期抗性基因丧失抗病性，造成育种可用的有效抗源和抗病基因资源越来越少、育成品种抗病性表现脆弱。较为突出的例子如20世纪80-90年代，致病性小种CYR31发生和流行后，大量利用Yr9单一抗源作为亲本育成的推广品种很快丧失了抗病性。此后，新小种CYR34又导致Yr10、Yr26基因和‘贵农22’血缘的抗源丧失抗病性。而含有成株期抗性基因的品种虽然苗期表现感病，但成株期表现抗病，且抗病性较为持久。研究还发现，品种中若仅含有某一个已“丧失”部分抗性的全生育期抗性基因，对条锈病表现感病，但与其他多个全生育期抗性或成株期抗性基因聚合后，对条锈病整体表现抗病至轻微感病。如‘Libellu-la’‘Strampelli’‘ Pascal，等品种含有3～5个成株期抗性位点，在条锈菌越夏菌源区陇南长期表现出优异的成株抗性，其中‘Libellula’和‘Strampelli’已保持抗性逾50年。因此，选育抗病基因聚合品种提高品种抗病持久性，是有效持续控制西北越夏菌源区小麦条锈病的重要策略。甘肃陇南作为小麦条锈菌核心越夏菌源区在我国小麦条锈病的防控中具有非常重要的地位，然而该区域的小麦品种在生产中多数表现抗病性时间短，具有稳定抗性且抗性较持久的品种较少。育种中利用单一成株期抗性基因，又存在秋苗菌源量增加、向外传播等问题。因此，综合利用全生育期抗病基因和成株期抗性基因，既能减少向外传播的秋苗菌源量，又能延长品种抗性保持年限。课题组前期研究中育成了含有成株期抗性基因Yr30/Lr27/Sr2，全生育期抗病基因YrZH84等基因的小麦品种‘兰天15号’，含有全生育期抗病基因Yr9、Lr37/Yr 17/Sr38和YrZH84的小麦品种‘兰天26号’，含有成株期抗性基因Yr30/L27/Sr2，全生育期抗病基因Lr37/Yr17/Sr38的小麦品系‘C69-17-13-14-15-6-1’。为了进一步提高品种的抗病持久性，通过常规育种结合分子标记辅助选择，培育聚合成株期抗性基因和全生育期抗病基因的新品种，为越夏菌源区甘肃陇南条锈病的品种遗传多样性持续控制奠定基础。

1材料与方法

1.1供试小麦

‘兰天15号’（选育系号95-62-1，甘审麦2004003）、‘兰天26号’（选育系号00-30-3-2，甘审麦2010007>、‘C69-17-13-14-15-6-1’（92-47航天诱变选育的新品系）均为课题组近年选育的适于甘肃陇南地区种植的冬小麦品种（系）。通过已知基因的分子标记检测结合抗病性鉴定，‘兰天15号’成株期对条锈病高抗至免疫，含有成株期抗性基因Yr30/Lr27/Sr2和全生育期抗病基因YrZH84；‘兰天26号’高抗条锈病，含有全生育期抗病基因Yr9、Lr37/Yr17/Sr38和YrZH84；‘C69-17-13-14-15-6-1’成株期具有高度慢病性特点，含有成株期抗性基因Yr30/Lr27/Sr2和全生育期抗病基因Lr37/Yr17/Sr38。利用‘C69-17-13-14-15-6-1，和‘兰天15号’杂交，聚合Yr9、Yr30/Lr27/Sr2、Lr37/Yr 17/Sr38和YrZH84选育出新品种‘兰天132，。利用‘C69-17-13-14-15-6-1’和‘兰天26号’杂交，聚合Yr9、Yr30/Lr27/Sr2和Lr37/Yr17/Sr38育成新品种‘兰天196’。利用已知抗条锈基因载体材料‘AvSYr9

NIL， （Yr9）、‘AvSYr17 NIL， （Lr37/Yr17/Sr38），‘Opata

85’（Yr27， Yr30）、‘Francolin’（Yr30）、‘92-47’ （Yr30）、‘周8425B’ （YrZH84）作为抗病对照品种，‘铭贤169，为感病对照品种。利用甘肃省区域试验和生产试验对照品种‘兰天19号’作为产量性状选择标准。

1.2DNA提取和基因型检测

采用植物基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）股份有限公司]提取小麦基因组DNA，并用1．0%的琼脂糖凝胶和微量分光光度计（Nano-Drop 2000，Thermo Scientific）检测DNA的完整性及浓度。分子标记为Yr9的黑麦特异性分子标记AVI/AV4，Lr37/Yr 17/Sr38分子标记VENTR-TUP/LN2，Yr30/Lr27/Sr2的分子标记csSr2和Xwms533．YrZH84分子标记Xcfa2040。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。标记检测试验于甘肃省农业科学院小麦研究所实验室完成。分子标记引物序列及PCR反应条件详见表1。

PCR反应体系（20.0pL）：2×Taq mix（天根生物科技有限公司）10uL，10.0 ng/uL。DNA 1uL，1．0umol/L标记引物各1uL，超纯水补足至20uL，PCR反应程序为95℃预变性2min；95℃变性30s，退火温度（表1）下退火40s，72℃延伸50s，30个循环；最后72℃延伸5min。分子标记AV1/AV4、VENTRTUP /LN2、csSr2的PCR产物利用1.0%～2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，Xcfa2040和Xurns533标记的PCR产物利用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

1.3田间试验

‘兰天26号’ב兰天15号’和‘C69-17-13-14-15-6-1’ב兰天26号’的杂交后代试验材料和对照材料分别于2007年-2015年和2012年-2019年种植于甘肃省农业科学院小麦研究所清水试验站（34.7°N，106.2°E）。采用常规育种系谱法对后代进行选育，在相邻小区种植高度感病品种‘晋麦47’和‘辉县红’作为条锈菌接种和诱发材料。每个组合的F1群体种植2行，行长1．0m，F2群體每个组合单株点播约3000粒，株距4．0cm，对抗病单株进行标记检测，对含有目标基因聚合体的单株的F3和F4群体采用行播，每个群体播种2行，行长1.5m，利用分子标记跟踪监测抗病单株，对丰产性好、含有目标基因聚合体的Fs株系进行小区产量比较试验，丰产性和产量均以甘肃省区域试验和生产试验对照品种‘兰天19号’为标准进行比较，筛选优异品系参加甘肃省陇南片区域试验和生产试验。

1.4条锈病抗病性鉴定

成株期抗病性鉴定于2019年-2020年种植季分别在甘肃省农业科学院小麦研究所清水县试验站、四川省农业科学院郫都区试验站进行。每个材料按行播种（行长1.5m），2次重复，以高感品种‘晋麦47’（甘肃）和‘铭贤169’（四川）作为感病对照品种。小麦拔节期接种甘肃省农业科学院植物保护研究所提供的混合小种（CYR34，Gui22-1，CYR32，CYR33，ZS类型）。在感病品种充分发病时进行成株期抗病性鉴定，反应型记载方法和苗期记载方法相同，严重度按叶面病斑面积占总叶面积的百分比计算。成株抗性综合评价按照《农作物抗病性鉴定技术规范

第4部分小麦条锈病》（DB52/T1501. 4-2020）的标准，反应型0为免疫，0；～1为高抗，2为中抗，3～4为慢病性，3为中感，4为高感。

苗期抗病性鉴定于2021年1月份在甘肃省农业科学院玻璃温室内进行，材料播种于塑料盒（直径8.0cm，高10．0cm）中，待出苗且第一叶伸展后分别接种致病性小种CYR33、CYR34以及混合小种，待感病对照品种‘铭贤169，充分发病后进行抗病性鉴定。按照《小麦区域试验品种抗条锈病鉴定技术规程》（NY/T 2953-2016）的0、0；、1、2、3、4记载反应型，反应型O为免疫，0；～2为抗病，3～4为感病，共调查3次，以最高反应型为最终抗病性结果。

2结果与分析

2.1小麦新品种‘兰天132’和‘兰天196’的选育

2007年-2015年，以抗病品种‘兰天26号’为母本（含Yr9、Lr37/Yr17/Sr38和YrZH84基因），‘兰天15号’为父本（含成株抗性基因Yr30/Lr27/Sr2），通过常规杂交系谱法结合分子标记辅助选择进行选育，在F2～F4分离世代，均通过分子标记辅助选择的方式成功获得聚合成株抗性基因Yr30/Lr27/Sr2、全生育期抗病基因Yr9、Lr37/Yr17／Sr38和YrZH84的植株，并依据植株的成株抗病性及农艺性状特点选择优异株系进行产量试验比较，最终选育出综合性状优良，且具有Yr30/Lr27/Sr2、Yr9、Lr37/Yr17/Sr38和YrZH84基因聚合体的新品系‘兰天132’（图1），2014年-2017年参加甘肃省陇南山旱地冬麦区域试验和生产试验，于2018年通过甘肃省品种审定（甘审麦20180012）。

2012年-2019年，以‘C69-17-13-14-15-6-1’（含Yr30/Lr27/Sr2）为母本，以‘兰天26号’（含Yr9、Lr37/Yr17/Sr38和YrZH84）为父本，通过常规杂交，系谱法结合分子标记辅助选择育成聚合Yr9、Yr30/Lr27/Sr2和Lr37/Yr17/Sr38育成新品系‘兰天196，（图1）。在F2、F3、F4分离世代，对具有抗病性且农艺性状优良的单株、株系进行分子标记跟踪检测，对中选的Fs株系进行产量和适应性试验，最终选择具有抗病基因聚合体，且高抗条锈病、丰产性好、适应性广的新品系‘兰天196’，并于2019年-2021年参加甘肃省陇南冬麦区区域试验，2021年-2022年参加生产试验，2023年通过甘肃省品种审定（甘审麦20230021）。

2.2条锈病抗病性鉴定

苗期分小种CYR33、CYR34和混合小种鉴定中，‘兰天132，和亲本‘兰天15号’‘兰天26号’对CYR33表现免疫，对CYR34和混合小种均表现感病；成株期抗病性鉴定中，‘兰天132，和亲本‘兰天15号’表现免疫，亲本‘兰天26号’表现抗病（反应型为0；～1），感病对照品种‘晋麦47’和‘辉县红’均高感条锈病，反应型4，严重度100%（图1，表2）。

对‘兰天196’进行苗期分小种CYR33、CYR34和混合小种鉴定，‘兰天196’和亲本‘C69-17-13-14-15-6-1’‘兰天26号’均对CYR33表现免疫，但对CYR34和混合小种均表现感病（反应型为3～4）；成株期抗病性鉴定中，‘兰天196，表现高抗至免疫，亲本‘C69-17-13-14-15-6-1’表现高度慢病性，严重度15%～20%，亲本‘兰天26号’表现抗病（反应型为0～1）（表2）。

2.3主要农艺性状及产量表现

小麦新品种‘兰天132，为冬性、无芒、株高95.0cm、穗粒数44.5个、小穗数18.0个、千粒重47.1g。2014年-2015年、2015年-2016年参加甘肃省陇南旱地冬小麦区域试验，平均产量6.4t/hm2，较对照品种‘兰天19号’增产5.9%。新品‘兰天196，为冬性、无芒、株高103.2cm、穗粒数47.3个、小穗数18.6个、千粒重44.1g。2019年-2020年参加甘肃省陇南旱地冬小麦区域试验，平均产量6.2t/hm2，较对照品种‘兰天19号’增产6.9%，居10个品系的第2位（表3）。‘兰天132’‘兰天196’均适宜在甘肃省陇南冬麦旱地品种类型区种植。

2.4 ‘兰天132’和‘兰天196’中已知抗病基因聚合体

用Yr9、Lr37/Yr17/Sr38、Yr30/Lr27/Sr2和YrZH84的分子标记检测亲本‘兰天15号’‘兰天26号’‘C69-17-13-14-15-6-1’，育成新品种及抗病基因载体对照材料，在‘兰天132’中检测到成株抗性基因Yr30/L27/Sr2、全生育期抗病基因Yr9、Lr37/Yr17/Sr38和YrZH84。在‘蘭天196’中检测到成株抗性基因Yr30/Lr27/Sr2、全生育期抗性基因Yr9和Lr37/Yr17/Sr38（图2，表4）。

3结论与讨论

基因聚合育种中，选择含有目标基因的亲本进行杂交至关重要。如果能够明确优良抗病品种中的抗性基因背景，可显著提高多基因聚合品种的选育成功率。中国农业科学院作物科学研究所品质实验室利用黄淮麦区主推品种‘百农64’和‘鲁麦21’杂交，育成了多基因聚合、兼抗型成株抗性小麦新品系。而西北越夏菌源区甘肃小麦抗病育种中多以引进抗源或抗病基因为抗病亲本和当地品种杂交，亲本中基因不清楚，抗病基因转育效率低。对抗病亲本‘兰天15号’‘兰天26号’和‘C69-17-13-14-15-6-1’进行已知抗病基因分析，发现小麦品种‘兰天15号’含有成株抗性基因Yr30/Lr27/Sr2和全生育期抗性基因YrZH84，‘兰天26号’含有全生育期抗性基因Yr9、Lr37/Yr17/Sr38和YrZH84，品系‘C69-17-13-14-15-6-1’含有全生育期抗性基因Lr37/Yr17/Sr38、成株期抗性基因Yr30/Lr27/Sr2及其他未知基因。冬小麦‘兰天15号’具有良好的丰产性、抗病性和广适性，曾在甘肃、陕西、宁夏、青海等地推广种植，‘兰天26号’是甘肃省冬小麦主栽品种，推广至今连续10余年推广面积占甘肃省小麦面积的第一位。‘C69-17-13-14-15-6-1’具有高产、持久抗病等特点。因此，利用该品种进行杂交，优异的性状有利于新品种（系）的选育。此外，选育的小麦新品种‘兰天132'和‘兰天196，聚合了具有持久抗秆锈和条锈性且兼抗叶锈的成株抗性基因Yr30//r27/Sr2、兼抗叶锈、条锈和秆锈基因Lr37/Yr17／Sr38或YrZH84，及全生育期抗病基因Yr9，多效性基因聚合提高了育成品种防御多种病害的能力。

曾庆东等对33份已知Yr基因的单基因系对主要致病性小种CYR32、CYR33和CYR34的表现进行了鉴定，发现仅有Yr5、Yr15和Yr61对中国当前主要流行小种抗病，‘周8425B，对3个主要流行小种具有全生育期抗病性，其他基因均表现不同程度的感病，但发现部分Yr基因聚合的载体品种成株期表现良好的抗病性，如‘Hyak' （Lr37/Yr17/Sr38，YrTye）、‘Compair' （Yr8，Yr19）等具有多个Yr基因的小麦对中国主要流行小种具有成株抗性。位于小麦3BS染色体的多效性抗病基因Yr30/Lr27/Sr2与主效基因Sr33聚合后抗秆锈性保持至今已迨70年。位于IBL染色体的多效性抗病基因Lr46/Yr29/Prn39/Sr58虽具有部分抗性，但具有持久抗性特点。聚合多效性基因Lr34/Yr18/Prn38/Sr57、Lr46/Yr29/Pm39/Sr58、Lr67/Yr46/Pm46/Sr55及其他抗病基因，是CIM-MYT、美国、澳大利亚、加拿大及我国开展持久抗病品种选育的重要策略。胡朝月等对小麦抗条锈病载体品系进行抗病性鉴定，发现Yr17的单基因系AvSYr17 NIL苗期对CYR17抗病（IT：1）、对CYR32中感（IT： 3+）、对CYR33和CYR34感病（IT：4），但成株期表现中感（IT：3～3+），具有一定的成株抗病性。近年来，以Yr5和YrZH22为抗源育成的品种已在生产中大面积推广，但已发现对Yr5、Yr15具有毒性的新小种，YrZH22苗期在天水自然发病的田间表现感病，说明对YrZH22具有毒性的小种也出现了。能用于我国小麦育种的全生育期抗性和成株抗病基因较少。因此，育种中增加成株抗病基因和全生育期抗性基因的利用，一方面可以延长品种的抗病性保持时间，另一方面可降低菌源基地小麦品种在苗期对病原菌的抗性选择压力，减少小种变异频率，降低新小种向主产区传输的频率。本研究聚合多效性成株抗性基因Yr30/Lr27/Sr2、全生育期抗病基因Yr9、Lr37/Yr17／Sr38和YrZH84，一方面通过基因聚合培育持久成株抗性品种，另一方面可减少在陇南育种中对Yr5、Yr15和YrZH22等有限的全生育期抗病基因的利用，减轻致病性小种的定向选择，延长Yr5、Yr15和YrZH22等基因的抗性保持年限。

聚合成株抗病基因Yr30/Lr27/Sr2和全生育期抗病基因Yr9、Lr37/Yr17/Sr38和YrZH84，育成适宜在甘肃陇南推广种植的小麦新品种‘兰天132’和‘兰天196’，成株期均高抗条锈病，并具有抗旱性和较好的丰产性。基因聚合育种对提高陇南小麦品种抗病持久性具有重要意义，也可为我国选育具有多基因聚合的成株抗性品种提供可行的育种方法和优异抗病亲本。