中国南方稻田及其周边环境根结线虫种类鉴定

徐幸 卓富彦 杨芳 袁斌 彭云良 郭荣 姬红丽

关键词：稻田；拟禾本科根结线虫；混合侵染；生物测定；特异性引物

根结线虫Meloidogyne spp．广泛分布于世界各地，是对全球农业危害最严重的植物病原线虫。根结线虫侵染植物根部后，根部外观畸形形成根结，导致根系的吸收能力降低，被害株地上部则长势衰弱、叶色异常，甚至提早死亡。此外，根结线虫的侵染还容易导致土壤中植物寄生性病原真菌侵入而造成复合侵染。目前，世界上已报道98种根结线虫，其中有40余种在我国已有发生记载。根结线虫可以随苗木、土壤、灌溉水和农用器械等传播扩大危害范围。随着我国农业种植结构调整，根结线虫病在我国发生和危害日益加重，一般病区导致作物减产15%～25%，部分田块损失更高达70%以上甚至绝收。

我国于1959年在海南省水稻上发现根结线虫病。进入21世纪后，稻田及其周边沟渠、菜地、苗圃等环境中不断发现拟禾本科根结线虫Meloido-gyne grarninicola，分布范围已包括海南、广东、广西、福建、湖南、浙江、湖北、江苏、江西、四川等多省。徐幸等发现成都平原40%的稻田及周边旱地受到数种根结线虫侵染，其中优势种为拟禾本科根结线虫。长期以来，水旱轮作被认为是控制根结线虫病的有效手段，但拟禾本科根结线虫危害性强，寄主范围广泛，并适应水旱轮作环境，其发生和传播将给各地水稻和其他作物生产带来严重问题，因此有必要全面了解根结线虫在我国水稻主产区的分布现状和种类，为制定相应的传播阻断策略和防控措施奠定基础。

1材料与方法

1.1样品采集

2019年11月-2020年2月．由全国农技推广服务中心组织南方水稻产区所在省（直辖市／自治区）农业厅植物保护部门，委托辖下2～3个县（市／区）植保植检站在3～5个乡（镇）采集土样，各乡（镇）选择一个点，采集连片稻田及周围旱地共10块田样品。田块不论大小均沿“Z"字形路线设10个取样点，挖取0～20cm耕作层土壤样品装袋，同一块田10个点共取土壤样品0.5～1.0kg，样品袋内装入记载样点地理位置和田块栽种作物类型信息的标签，连同样品清单寄往四川省农业科学院植物保护研究所实验室。共采集了15个省（直辖市／自治区）的48个县（市／区）的1181份土样（表1）。其中海南72份，广东60份，广西60份，福建130份，上海82份，江苏90份，安徽60份，江西100份，湖南110份，湖北64份，四川90份，重庆60份，云南83份，浙江60份，贵州60份。

1.2根结线虫生物测定

2020年3月初将采集的各田块土样粉碎，每份土样加入一定体积的灭菌河沙（土样和河沙体积比为3：1）后充分混匀，平均分成3份放入带托盘（直径15cm）的盆（下底直径14cm）中，共计3543盆。浇透水后，每盆土壤表面一半播种20粒左右市购番茄种子（‘美国红冠’，四川省良明农业科技有限公司），另半边播种20粒左右水稻品种‘日本晴’种子。种子表面覆盖一层灭菌细土后，用75%百菌清可湿性粉剂600倍稀释液喷雾至稍有积水以预防立枯病。花盆摆放在塑料大棚内，20d后温度稳定上升后移至网室内水泥池中。晴天时每天用喷雾器喷细雾以保持土壤湿润，阴雨天用塑料薄膜覆盖防止雨水冲淋。托盘之间始终保持2cm以上距离，以避免花盆间线虫交叉污染。培养50d后，拔取水稻和番茄根系洗去泥沙，调查每盆中2种植物根系有无根结形成，同一块田3次重复有1次及1次以上水稻或番茄根系有根结产生，此土样计为阳性，3次重复2种植物根系均未产生根结则记为阴性。检出率一阳性土样数／总土样数×100%。

1.3根结线虫分子鉴定

收集生物测定检出根结的水稻和番茄根系，小心洗净泥沙后用消毒剪刀剪碎根系，剪破根结，用浅盘分离法分离获得线虫悬浮液。线虫悬浮液于4℃冰箱静置过夜，收集底部线虫于2mL离心管中，再将离心管液氮速冻30s后放在振动磨样机中磨样30s，按照徐幸等的方法提取线虫DNA备用。用我国常发生的6种根结线虫特异性引物（表2）进行种类鉴定。PCR扩增体系为25uL：2×RapidTap Master mix（诺唯赞）12.5uL，10umol/L上、下游引物各1uL，模板DNA 1uL，超纯水补足至25uL。PCR扩增程序：95℃3 min;95u15s，退火温度下退火15s（退火温度见表2），72℃1min，35个循环；72u5min．12u保存。以灭菌ddH20作为阴性对照，实验室收集的6种根结线虫标准DNA样品作为阳性对照。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶110V电泳25min进行检测，在凝胶成像仪上观察并照相。能够扩增出某线虫特异性条带的样品计为该样品对该线虫为阳性。种类检出率一检出某种根结线虫的土样数／分子鉴定总土样数×100%。

2结果与分析

2.1各地土样根结线虫检出率

15个省（直辖市／自治区）采集的土样中均有部分土样导致水稻或番茄根系产生根结，生物检测结果表明，阳性土样为312份，总检出率为26.42%（表3）。其中来自广西的土样检出率最高，达到56.67%，其次为福建土样，检出率为53.08%。广东、湖南和浙江土样检出率分别为41.67%、42.73%和45.00%；海南、安徽、江西、湖北、重庆、贵州和云南的土樣检出率在11.67%～23.33%;上海、江苏和四川的土样检出率则均在10%以下。

在15省（直辖市／自治区）的48县（市／区）中检测出阳性土样的有45个区（县）。其中最高检出率为73.33%，来自湖南省长沙市宁乡市；其次福建省仙游县和广西陆川县检出率均为66.67%；福建省漳州市漳浦县检出率为63.33%；福建省南平市顺昌县检出率为60.00%。来自四川、重庆、贵州、江苏和上海等省（市）各县（市／区）的土样样品检出率均较低，最高不超过20%。样品未检测出根结的有上海市的嘉定、浦东和松江3个区（表4）。

2.2根结线虫种类鉴定

利用6种线虫特异性引物，在171份阳性土样DNA中成功检测并鉴定出6种已知根结线虫：拟禾本科根结线虫、北方根结线虫M．hapla、花生根结线虫M．arenarza、爪哇根结线虫M．jauoanzca、象耳豆根结线虫M．enterolobii和南方根结线虫M．in-cognita，平均检出率分别为88. 89%、41. 52%、29.82%、10.53%、4.09%和3.51%（表5）。6种根结线虫导致水稻或番茄出现的根结症状（图1）。其中拟禾本科根结线虫在调查的15省（直辖市／自治区）均有分布，北方根结线虫在贵州、重庆、安徽和江西以外的调查省（直辖市／自治区）均有分布，花生根结线虫在四川和湖北外的调查省份的稻田或周边环境中均有分布，爪哇根结线虫分布在安徽、云南、海南、浙江、广西和福建稻田或周边环境土壤中，南方根结线虫分布在云南、浙江、湖南和福建稻田或周边环境土壤中，象耳豆根结线虫分布在重庆、云南、湖南和福建的稻田或周边环境土壤中。

所有调查省份均有2种及以上根结线虫发生。其中湖北、江西、贵州和四川检测到2种，广东、安徽、重庆、江苏和上海检测到3种，广西和海南检测到4种，浙江和湖南检测到5种，福建和云南检测到6种，各省检测出具体种类见表5。从采样区县看（表4），云南省西双版纳检测出6种根结线虫，福建省仙游县、福建省南平市顺昌县和浙江省金华市婺城区检测出5种根结线虫，4种根结线虫混合发生的区（县）有广西陆川县、浙江省衢州市龙游县、湖南省长沙宁乡、湖南省益阳市赫山区、湖南省常德市汉寿县、福建省漳州市漳浦县和海南省海口市龙华区等7个区（县）。

在完成分子检测的171块田中，受1、2、3、4、5种和6种根结线虫侵染的土样比例分别为：42.11%、41.52%、12.87%、2.92%、0.58%和0，其中最常见的为拟禾本科根结线虫单独侵染（34.50%）、拟禾本科根结线虫与北方根结线虫（22.81%）和拟禾本科根结线虫与花生根结线虫（13.45%）2种混合侵染，这3种根结线虫混合侵染的田块占比为5.26%，拟禾本科根结线虫、北方根结线虫和爪哇根结线虫3种线虫混合发生的田块比例为3.51%，其他根结线虫单独和混合发生田块数均不超过2块田，其中来自云南西双版纳勐海镇的一块田同时检出了拟禾本科根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫和南方根结线虫，但无象耳豆根结线虫（表6）。

3结论与讨论

早在20世纪20年代，海南省即发生水稻根结线虫病，至20世纪70、80年代，该病在海南已经扩展到多个县，并在广西浦北等地也有发现，分别鉴定为海南根结线虫M．hainanenszs、林氏根结线虫M．lini，目前这2个命名种已被归并到拟禾本科根结线虫。刘国坤等将福建省水稻及周边环境杂草上根结线虫鉴定为拟禾本科根结线虫，并为多地所证实。徐幸等研究发现稻田及周边环境土壤中有拟禾本科根结线虫、花生根结线虫等多个种存在，同一田块中有不同种根结线虫混合发生。本研究表明，拟禾本科根结线虫已成为我国南方稻区的主要优势种，在同一块田常常与北方根结线虫或花生根结线虫混合发生。据报道，拟禾本科根结线虫适应不同生态环境，可以占领稻田、旱地、沟渠、绿化带、浅滩等多种生境，这可能是拟禾本科根结线虫成为水稻田优势种的主要原因。而其他线虫在淹水环境下不能长期生存，稻田土样里分离鉴定到这些种类，可能是由于其在周边旱地中发生后随灌溉水流入稻田并在水稻收获后被采集，当然也不能完全排除这些种类中产生了能适应较长时间水淹的新种群，因而值得进一步研究，

目前，水稻根结线虫在南方水稻主产区已经普遍发生。有证据表明，中国拟禾本科根结线虫来源比较单一。笔者根据对水稻生产地区的调查，认为随着20世纪80年代末水稻“两系杂交稻”育种大规模开展，我国水稻南繁育种从海南往内陆地区运输幼苗，可能是拟禾本科根结线虫迅速扩散传播的一个重要途径。由于目前该线虫已广泛分布，加上线虫寄主范围广，生境多样，我国南方稻区已经失去了通过检疫阻止其扩展的机会窗口。进一步摸清华北、西北和东北稻区拟禾本科根结线虫在品种选育、集中育秧基地的发生现状，以及该线虫在北方大棚和露地低温环境的适应能力，制定必要的检疫管理措施仍具有重要意义。

近年来，水稻（水、旱）直播、旱育秧、湿润育秧、有氧灌溉等新栽培措施，更有利于水稻根结线虫病发生，而集中育秧和工厂化育秧基质一旦受到根结线虫污染，引致的损失更加严重。因此，各地和水稻种植大户有必要对本地水稻根结线虫污染情况进行摸底调查。本研究所采用的生物测定方法简单易行，值得大力推广。

据初步测定，目前生产上缺乏抗水稻根结线虫病的品种。国内外研究表明，包括化学药剂在内的防治方法，都难以根除土壤中根结线虫，因此在水稻根结线虫病发生地区．应采取综合防治措施，在加緊抗性品种选育的同时，尽量避免在病田、病基质直播和育秧，苗期宜采用淡紫拟青霉Purpureocilli-um lilacinun和噻唑膦等杀线虫剂交互使用的方法进行防治，以减轻根结线虫的危害。防治时，也应注意稻田周边田埂、道路、水渠和旱地等环境中根结线虫的防治。本研究中还有一些土样导致水稻或番茄产生了根结，但由于DNA提取数量和质量原因，未能成功进行分子鉴定；这些土样，以及已成功检测出已知根结线虫的土样中，均不能排除还有其他的根结线虫种类发生，仍需进一步重复取样、分离培养和鉴定。