肺鳞状细胞癌中解聚素-金属蛋白酶17下调对自然杀伤细胞杀伤作用的影响

2023-12-28 04:36罗小宁王钇力王祥财
赣南医学院学报 2023年10期
关键词:孵育蛋白酶生存率

罗小宁,张 羽,王钇力,王祥财

(赣南医学院第一附属医院肿瘤科,江西 赣州 341000)

肺鳞状细胞癌(Squamous cell carcinoma,SCC)是非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)中较常见的病理亚型,约占NSCLC 的30%[1]。尽管吸烟习惯的改变降低了SCC 的发病率,但仍缺乏有效的治疗方案来改善肺SCC 患者的预后[2]。近20 年来,铂基双体化疗被认为是肺SCC的标准一线治疗方案。新的治疗方法,主要包括贝伐单抗、间变淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase,ALK)抑制剂、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂等,显著提高了腺癌患者的总生存期,但对肺SCC 患者的治疗效果不明显[3-4]。因此,寻求新的治疗方法对肺SCC患者十分迫切。

自然杀伤细胞(Natural killer cell,NK cell)是机体内重要的免疫细胞[5]。NK 细胞在没有预先抗原致敏的情况下高效杀伤和产生细胞因子[6-7]。NK 细胞功能可受不同信号通路的调控[8]。ADAM17 是metzincin 金属蛋白酶超家族的adamalysin 亚家族的成员,它含有一个保守的蛋氨酸氨基酸,同时含有毗邻蛋白酶催化区域的锌结合基元[9]。ADAM17已被证明在癌细胞中过表达,并导致癌细胞释放EGFR 配体和黏附分子,促进生长和转移[10]。综上所述,下调ADAM17 活性可能以直接和间接的方式抑制肿瘤细胞生长和存活[11]。有研究[12]报道了人类NK细胞表达ADAM17,并且NK细胞中ADAM17的过度激活可能会导致CD16 和CD62L 表达下调,进而损害其效应功能。但目前尚不清楚在肺SCC中抑制ADAM17 表达对NK 细胞转运及其功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料人NCI-H520 细胞株购自ACTT 公司,Lipo 2000转染试剂购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司,NK 细胞激活扩增试剂盒、磁性激活细胞分离(MACS)试剂盒、qRT-PCR 试剂盒购自Thermo Fisher Scientific 公司,阴性对照siRNA、ADAM17 siRNA 由上海吉凯基因医学科技股份有限公司合成,ADAM17、GAPDH 引物由上海生工生物工程有限公司合成,ADAM17、γ 干扰素(IFN-γ)、颗粒酶B(GraB)、穿孔素(PFP)、GAPDH 抗体购自Affinity Biosciences LTD 公司,CCK-8 试剂购自南京建成生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与分组将NCI-H520细胞培养于RPMI1640 培养基中,细胞在培养瓶内生长到融合度为80%时进行消化传代。其中阴性对照组、ADAM17 下调组NCI-H520 细胞使用Lipo 2000 转染试剂分别转染nonsense siRNA、ADAM17 siRNA。

1.2.2 NK细胞制备取志愿者外周静脉血10 mL,加入PBS 缓冲液,混匀后采用密度梯度离心法分离出单个核细胞,使用PBS 缓冲液进行洗涤,按照MACS 试剂盒操作步骤分离出CD3-CD56+NK 细胞,按照NK细胞激活扩增试剂盒操作步骤对NK细胞进行激活扩增,随后对NK细胞使用含500 U·mL-1重组白细胞介素2的培养基培养。

1.2.3 qRT-PCR 检 测 各 组NCI-H520 细 胞ADAM17 mRNA 表达分别提取各组细胞的总RNA,逆 转 录 合 成cDNA,采 用qRT-PCR 检 测ADAM17 mRNA 表达水平。按表1 设计引物,使用2-ΔΔCt法进行计算相对表达量。

1.2.4 Western blotting 检测各组NCI-H520 细胞中各种蛋白表达用BCA 法测定各组细胞的总蛋白质浓度。配置样品并将待测样品加入加样孔,将电压设置为70 V 开始电泳,待两边的Protein Marker分开后将电压调至120 V。将电流设置为200 mA进行转膜,洗膜,一抗4 ℃孵育过夜,洗膜。二抗室温孵育1 h,洗膜,免疫反应化学发光法显色。

1.2.5 NK 细胞杀伤活性检测各组按20∶1(NCI-H520 细胞∶NK 细胞)加入100 µL NK 细胞,同时设立相应的空白对照组。孵育24 h 后,每孔加入CCK-8试剂20 µL,继续孵育4 h后,于酶标仪450 nm处检测每孔光密度(OD)值,计算细胞生存率。

1.3 统计学处理利用Graphad Prism 8.0 软件进行分析,数据用均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 各组细胞ADAM17 mRNA 和蛋白表达与正常对照组相比,阴性对照组ADAM17 mRNA 和蛋白表达无明显差异,ADAM17 下调组ADAM17 mRNA 和蛋白表达显著减少,差异有统计学意义(P<0.01)(图1)。提示ADAM17 低表达的NCI-H520细胞系构建成功。

图1 各组细胞ADAM17 mRNA和蛋白表达

2.2 NK 细胞对各组NCI-H520 细胞生存率的影响与正常对照组相比,阴性对照组NCI-H520 细胞生存率差异无统计学意义,而ADAM17 下调组NCI-H520细胞生存率明显降低(P<0.01)(图2)。

图2 NK细胞对各组NCI-H520细胞生存率的影响

2.3 各组细胞IFN-γ、GraB、PFP 蛋白表达与正常对照组相比,阴性对照组IFN-γ、GraB、PFP蛋白表达均无明显差异,ADAM17 下调组IFN-γ、GraB、PFP蛋白表达明显上调,差异有统计学意义(P<0.01)(图3)。

图3 各组细胞IFN-γ、GraB、PFP蛋白表达

3 讨论

SCC 是一种高度异质性的肺部恶性肿瘤,具有易突变、难治疗的特点[13],近年来,随着免疫研究领域的发展,一些基于免疫治疗的一线方案已进入临床[14]。NK 细胞是重要的免疫细胞之一,具有多种生物学功能,如抗肿瘤、抗病毒感染等,同时还与机体的自身免疫性疾病相关[15]。NK 细胞在杀死和产生细胞因子方面非常有效,无须预先抗原致敏。NK的功能反应受到激活和抑制信号的严格调控[16]。MISHRA H K 等[17]报道了人类NK 细胞可以表达ADAM17。ADAM17 最初被称为肿瘤坏死因子α 转化酶,ADAM17 是跨膜蛋白酶的去整合素和金属蛋白酶(ADAM)家族的成员,参与一些细胞膜蛋白的脱落和调节各种信号通路。有研究[18]表明,ADAM17在小鼠关节软骨中的表达与关节炎的发展呈正相关,其缺失可减轻关节软骨退化。此外,ADAM17与肾小球炎症和纤维化有关,在糖尿病小鼠中,近端小管中的ADAM17 缺失改善了葡萄糖耐量,防止足细胞丢失,并抑制了肾小球巨噬细胞和胶原的积聚[19]。更重要的是,ADAM17参与了包括肺癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌和宫颈癌在内的多种癌症的发生和发展[20-24]。然而,关于这种金属蛋白酶在肿瘤中的异常表达与其免疫调节之间的关系研究甚少。

当NK 细胞活化后会产生大量的IFN-γ、GraB、PFP蛋白,这些蛋白在发挥免疫保护方面有重要作用。有研究[17]指出,抗ADAM17 单克隆抗体MEDI3622与肿瘤细胞结合后,能增强NK 细胞与肿瘤细胞结合,进而增强人NK 细胞的IFN-γ 释放。本研究表明,在低表达ADAM17 后,IFN-γ、GraB、PFP 蛋白的表达量均显著升高,这进一步证明了在NCI-H520细胞中ADAM17 下调对NK 细胞有一定的激活作用,所以在肺SCC 细胞NCI-H520 中低表达ADAM17 后可显著增强NK细胞对其的杀伤作用。

总之,ADAM17 调节90 多种底物,其中一些与肿瘤的形成和发展密切相关。此外,ADAM17还参与调控免疫蛋白及其底物介导的信号通路。ADAM17被认为是治疗肿瘤的主要靶点,但其免疫调节作用和机制尚不清楚。本研究证明了在肺SCC 细胞NCI-H520中ADAM17下调可促进NK细胞对其的杀伤作用,可为后期肺SCC 寻找免疫治疗靶点提供新的理论依据。

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