环状RNA在心血管疾病中的研究进展

任佳容,张 芸

(1.内蒙古医科大学,内蒙古 呼和浩特010059;2.内蒙古医科大学附属医院全科医学科,内蒙古 呼和浩特010050)

近年来由于社会老龄化的增加、生活节奏的加快和饮食习惯的改变,我国心血管疾病(Cardiovascular diseases,CVD)病死率占全球CVD比例不断上升[1]。虽然近年CVD在诊断和治疗上取得一些进步,但我国CVD的发病率及病死率仍呈上升趋势,大多患者远期预后效果较差,发病年龄也逐渐呈年轻化趋势,从分子水平上寻找早期诊断疾病的新型生物标志物是这几年的热点。已有研究发现,circRNA是一类不编码蛋白质的特殊RNA,呈共价闭合环状结构,通过参与调控基因的转录与翻译在细胞增殖、凋亡、衰老等多种生命活动及疾病中发挥着重要调控作用,其中circRNA在心血管疾病中的发生发展机制、功能作用、早期诊断等方面越来越受到重视。本文就其在心血管疾病中的研究现状及进展进行系统综述以期为治疗心血管疾病提供新方案。

1 环状RNA的生成机制

近年来,随着生物信息学技术的飞速发展,在不同生物体内发现了环状RNA[2],如病毒、真菌和哺乳动物等。与传统线性RNA结构不同,circRNA是信使RNA(messenger RNA,mRNA)前体加工后的一个重要产物,其过程是前体mRNA下游3’端与其上游的5’端在剪接体和RNA聚合酶Ⅱ(RNA Polymerase Ⅱ,RNA Pol Ⅱ)的共同作用下反向相连形成由3’-5’磷酸二酯键构成的环状闭合转录产物,这种剪接机制称为反向剪接[3]。目前已有的报道指出环状RNA通过四种剪接方式形成[4],分别是外显子跳跃形成套索驱动模型、富含Alu重复序列的内含子自身反向互补配对环化的驱动模型、拉近相邻两个侧翼内含子的RNA结合蛋白(RNA Binding Protein,RBP)介导模型、内含子套索去脱分支化。基于选择性剪接,可分为三种环状RNA:仅由外显子组成的环状RNA(Exonic circRNA,ecircRNA)、仅由内含子组成的环状RNA (Circular intronic RNA,ciRNA)及外显子内含子均包括的环状RNA(Retained-intron circRNAs,EIciRNA)。大多数已知的环状RNA多为第一种环状RNA,被运输到细胞质中[2],少数环状RNA为第二种和第三种类型包含内含子序列的环状RNA,局限于细胞核中[2]。作为一种新型内源性非编码RNA,circRNA具有一定的稳定性、组织时空特异性及保守性使得circRNA有望成为新型诊断生物标记物及心血管疾病分子治疗新靶点,是分子生物学领域的最新研究热点。

2 环状RNA的功能

随着研究者们不断深入研究非编码RNA,circRNA的作用机制及生物学功能也日益被人们所揭晓。目前有研究认为其主要功能有以下几个方面:

2.1 环状RNA作为微小RNA分子海绵 环状RNA充当miRNA的海绵分子的机制是指circRNA含有能与微小RNA(microRNA,miRNA)结合的应答元件,通过竞争性结合miRNA并抑制其活性,最终影响其目标基因表达,从而参与各种疾病的病理发展进程。如性别决定区Y区(circSRY)产生的睾丸特异性circRNA,通过16个miR-138的结合位点[2],结合miRNA并抑制miRNA与目标mRNA结合的能力,导致mRNA的表达增加。目前有很多研究发现大多环状RNA拥有这一功能[5],这也是研究circRNA功能里最为成熟的一种。

2.2 环状RNA作为基因表达转录后调节因子 circRNA可以通过增强亲本基因的表达发挥功能,如由胰岛素基因的第二个内含子产生的ciRNAs[6],其主要定位于核内,可与一种叫做RBP即DNA结合蛋白43(DNA-binding protein 43,TDP43)相互作用,进而控制胰岛素分泌相关基因的转录,这种circRNA的水平在2型糖尿病患者的胰岛中降低,这表明它可能有助于疾病的发展。

2.3 环状RNA 海绵环状RNA还可作为蛋白质海绵,circFoxo3上同时存在MDM2 (Mouse double-minute 2,MDM2)和p53蛋白的结合位点,circFoxo3能促使MDM2诱导的p53泛素化,导致p53蛋白的整体降解[7]。最新研究发现,N6-甲基腺嘌呤 (N6-methyladenosine,m6A)修饰的环状RNA能与m6A识别蛋白结合,m6 A阅读蛋白通过募集适配器蛋白12,介导核糖核酸内酶复合物降解环状RNA[8]。

2.4 circRNA 可编码蛋白质因为5’端7-甲基鸟嘌呤-3磷酸核苷帽子结构和3’端多聚腺甘酸尾巴结构是成功编码RNA的重要条件,而circRNA缺乏以上结构,基于这个特点circRNA被认为无法进行蛋白翻译过程。但近来有研究在心肌炎病毒中发现,根据特异的短RNA序列即内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site,IRES)[9],circRNA也可与核糖体识别并结合IRES进行蛋白质的合成过程,这提示了circRNA的蛋白质翻译不依赖5’帽子结构也可进行,一项研究发现circβcatenin的蛋白编码能力均由IRES驱动[10]。除此之外,在5’ 非编码区域m6A修饰是另一种环状RNA翻译机制,具体起始翻译的机制尚不清楚,但目前已有研究发现,m6A介导的翻译需要真核翻译起始因子4和m6A读卡器,甲基转移酶3和甲基转移酶14可以增强m6A的翻译,而去甲基化酶脂肪块和肥胖相关蛋白和烷基化DNA修复蛋白阻断m6A介导的翻译过程,这表明m6A的修饰是可逆的[11]。然而,circRNA翻译的调控机制以及延伸和终止的过程目前仍未完全了解。

3 环状RNA与心血管疾病

全世界死亡的主要原因之一就是心血管疾病,每年大约有1790万人死于心血管疾病,心血管疾病已对人类生命健康构成重大威胁。目前越来越多的非编码RNA在心血管疾病的发生和发展过程中扮演着重要角色,包括心肌梗死、心脏衰竭、动脉粥样硬化、高血压、心肌纤维化。下面具体介绍不同环状RNA作为“miRNA海绵分子”在心血管相关疾病中的作用。

3.1 心肌梗死 有研究表明miR-133a是一种心脏伤害因子[12],其作用是抑制结缔组织因子表达,加速了心肌细胞的凋亡。而作为miR-133a的海绵,circHipk3在新生小鼠心肌中的表达量远高于成年小鼠,随后研究发现circHipk3/miR-133a/Notch1调控轴是促进心肌梗死后心脏修复,改善心功能的有效治疗靶点,受上游转录因子Gata4正向调控的circHipk3一方面通过诱导下游分子Notch1胞内结构域(Notch1 intracellular domain,N1ICD)乙酰化增加蛋白稳定性,另一方面调控细胞周期进程促进心肌细胞(Myocardial cells,CM)增殖。此外,过表达的circHIPK3可参与CM与内皮细胞(Endothelial cells,EC)之间的通信,不同于传统观点认为细胞间通讯是circHIPK3协调CM和EC的关键环节,Si等推测circHIPK3通过诱导血运重建向再生组织提供营养和氧气有利于CM增殖,但该研究未指出circHIPK3是否通过其他方式如细胞膜供受体作用或释放生长因子等可溶性分子参与心肌再生与血管生成之间的通信。同理,circCDYL被证实也参与调控心肌梗死后心脏再生和修复,Zhang等[13]研究发现随着上调circCDYL,细胞增殖指标表达也增加,有趣的是,敲除或下调circCDYL后心脏再生作用被抑制减弱。通过生物信息学预测证实了circCDYL能够充当miR-4793-5p的海绵并对其负调控。此研究再次证明环状RNA是一种新的心脏再生调控因子,其稳定性强不易受核酸酶水解影响,在血液中作用持续时间长,为该病的临床预后和有效的干预治疗提供实验依据。这些研究为心肌梗死调控通路、治疗及预后提供全新的思路。综上所述,circ-010567通过靶向结合miR-141间接调控不同信号通路,最终影响心肌梗死发展进程,这提示circ-010567是治疗MI的潜在靶点,对于circ-010567是否还存在其他调节机制如miR-141相关的其他信号通路及新的靶miRNA,有待进一步深入研究。

3.2 心力衰竭 Han等[14]建立心衰组5例及对照组4例,采集外周血通过下一代测序技术进行差异性表达分析发现心衰组外周血共有56个差异表达的环状RNA,其中29个上调,27个下调,增加样本量后通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)分析验证circ-0097435水平显著升高。研究还发现在阿霉素治疗的心肌细胞中circ-0097435水平明显上升,而沉默circ-0097435则抑制心肌细胞凋亡。进一步研究证实随着circ-0097435表达增加,多个miRNA被显著下调(miR-6799-5P、miR-5000-5P、miR-609、miR-1294),这提示circ-0097435可能通过结合上述miRNA在心力衰竭中发挥作用。然而该研究关于circ-0097435如何间接调控miRNA下游靶基因的表达仍存在局限,需要后续进一步探讨。环状RNA调控心肌细胞凋亡不仅可负向调控也可以正向调控,比如circHIPK3加速心力衰竭的作用已被证实,Deng等[15]发现心肌梗死后的小鼠心脏中circHIPK3水平显著升高,而下调circHIPK3可减轻心肌梗死后继发的心肌纤维化及心力衰竭。生物信息学分析表明circHIPK3参与肾上腺素能信号转导通路,其主要通过miR-17-3p-腺苷环化酶6型(Adenosine cyclase 6,ADCY6)轴增强肾上腺素对心脏的激活作用从而参与心力衰竭的发生。进一步分析发现钙浓度的增加与circHIPK3的过表达密切相关,下调circHIPK3后钙浓度也随之降低,而ADCY6是miR-17-3p的靶基因,其中ADCY6属于钙抑制家族的一种亚型,过表达的circHIPK3通过与miR-17-3p结合,上调ADCY6表达水平。而心力衰竭是急性心肌梗死的常见并发症之一,心力衰竭的发生可增加心肌梗死治疗后主要心血管事件的发生率,有研究指出circHIPK3也参与心肌梗死发展进程,我们猜想circHIPK3可能是心肌梗死后合并心力衰竭潜在诊断靶点,但其中的作用机制目前尚未阐明。已有研究[16]发现敲除AGC蛋白激酶家族成员3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶 1(PDK1)后加重心肌梗死诱导的心力衰竭小鼠心血管重塑,其机制可能与PDK1基因敲除加重炎性反应有关,这项研究提示circHIPK3也可能通过调控炎症因子从而参与心肌梗死后心衰的发生,其具体作用机制仍有待深入研究。

3.3 动脉粥样硬化 动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是心血管疾病的病理基础,是指由于血管内皮细胞暴露于各种致病因素如氧化低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein,ox-LDL),内皮完整性因被破坏释放各种细胞因子参与AS的同时促使血中过多脂肪在血管壁沉积并不断刺激发生慢性炎症反应,不稳定斑块破裂后引发血栓形成,最终堵塞动脉管腔造成不同程度的狭窄和闭塞。除了肌钙蛋白、肌酸激酶同工酶等心肌标志物及凝血酶时间等凝血功能指标[17]可用于临床诊断冠心病,目前已有多种不同环状RNA被发现可能参与冠状动脉粥样硬化性心脏病的发展[18]。已知ox-LDL是造成动脉粥样硬化的危害因素之一,一项涉及30例AS患者的研究中发现相较于健康对照组circPTPRA表达量明显增加,随后构建的ox-LDL处理血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)检测circPTPRA表达也明显上调。通过生物信息学技术检测结果表明过表达的circPTPRA通过抑制miR-636和上调特异性蛋白1(Specificity protein 1,SP1)信号轴可促进ox-LDL诱导的VSMCs的增殖,抑制细胞凋亡,调节AS进展[19]。此外,Wang等[20]结果表明,在ox-LDL诱导的巨噬细胞中,过表达circ-0050486通过靶向miR-1270及miR-145调节炎症因子的表达。实验表明,circ-0050486能够充当miR-1270及miR-145的海绵作用并抑制其活性,故下调circ-0050486后可对炎症因子白介素6(Interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)起到抑制作用,众所周知,炎症在AS进展中起着关键作用,故推测circ-0050486还可通过影响炎症发展改善AS进程。也有体内研究发现circ-0001946表达量在冠心病患者外周血中显著上调,并作为冠心病发病的独立风险因素[21],circ-0001946也称为小脑变性相关蛋白1反义转录本,其具有miR-7-5p的结合位点,通过海绵化调控作用于miR-7-5p上调多聚adp-核糖聚合酶1 (Poly adp ribose polymerase,PARP1)的表达,这表明circ-0001946-miR-7-5p-PARP1联合轴对评估冠心病风险严重程度具有重要意义。综上所述,多种试验表明冠状动脉粥样硬化的发生发展可能与circRNA-miRNA-mRNA轴密切相关,再次表明了circRNA是冠心病的前瞻性临床诊断生物标志物。

3.4 高血压 高血压是以动脉血压持续升高为特征的慢性疾病,是由环境因素和遗传因素引起的多因素疾病,分为原发性和继发性高血压,如今越来越多的人受到高血压的影响,并以原发性高血压(Essential hypertension,EH)较常见,但其病因仍未具体明确。有研究表明相较于对照组,EH组和TNF-α处理的人主动脉内皮细胞(Human aortic endothelial cells,HAECs)组、人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)组中circ-0105015的表达明显更高,是EH的独立危险因素。研究发现在EH组、HAECs组和HUVECs组中miR-637呈低表达,生物信息学软件预测circ-0105015 与miR-637之间有两个预测的结合位点,故推测circ-0105015可能通过靶向miR-637参与EH的发生发展。而TNF-α是一种重要的促炎因子,通过促进活性氧的产生诱导氧化应激,导致内皮功能障碍,从炎症和内皮功能障碍的角度认为circ-0105015-miR-637-TNF-α轴对高血压的发病机制具有潜在诊断价值[22]。另一项研究根据芯片分析结果显示circ-0037897在EH组高表达[23],通过进一步技术分析发现circ-0037897可海绵结合并负向调控能参与血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)表型转化的miR-145-5p,后者又通过干扰能影响VSMC重构的Wnt信号通路最终导致EH的形成。除此之外,介导血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,AngⅡ)生成增加的血管紧张素转换酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)也是miR-145-5p的靶基因,而AngⅡ表达增加是高血压危险因素之一,miR-145-5p通过抑制ACE的表达成为保护因子。这些结果表明circ-0037897为EH的早期诊断、治疗和预后评估提供依据。除了高血脂、高血压的危险因素还包括高血糖、精神紧张等,我们还可以研究探索环状RNA与其余危险因素发生发展的关系,从而在治疗高血压的方向开辟新的治疗思路。

3.5 心肌纤维化 心脏纤维化(Myocardial fibrosis,MF)主要是由于心脏成纤维细胞(Cardiac fibroblasts,CFs)功能被激活,分泌过多的细胞外基质引起心脏组织变性,长期发展最终导致健康心肌逐渐被纤维组织替代发生心脏重构。circRNA-miRNA-mRNA轴通过影响CFs生成机制参与调节心肌纤维化发生。已有研究证实CFs增殖和表型转化是AMI后心肌纤维化重要的影响因素,CFs受巨噬细胞分泌物刺激转变为肌成纤维细胞可发生纤维化修复梗死区域,长期持续刺激则导致心肌组织硬化。研究发现,心肌梗死小鼠和经肾素血管紧张素Ⅱ(Renin angiotensin Ⅱ,AngⅡ)处理的CFs中circCELF1的表达量显著减少,其过表达能够抑制AngⅡ对CFs的激活,这是由于过表达的circCELF1通过上调脂肪量和肥胖相关蛋白表达降低DKK2 中m6A水平从而抑制miR-636与DKK2的结合,促进DKK2的表达,而DKK2不仅抑制纤维化过程而且能增强血管生成,由此可知circCELF1可通过m6A和miR-636调控DKK2的表达,抑制MF的进展[24]。另外一项研究发现从LAS1L基因转录而来的circLAS1L在AMI患者中呈低表达,但过表达的circLAS1L可以与miR-125b吸附结合抑制其活性从而上调靶基因卷曲相关蛋白5(Secretfrizzle related protein 5,SFRP5)的表达,最终抑制CFs的激活、增殖和迁移及促进细胞凋亡[25]。这些发现为进一步了解发病病因提供了基础,寻找新的治疗靶点,提高心肌纤维化的诊断和预后具有重要意义。

4 展 望

由于饮食、生活习惯等影响,心血管疾病表现是多方面的,不同年龄临床表现也不尽相同,如今在高速发展的时代,越来越多的人长期熬夜超负荷工作,精神压力大等等导致发病率病死率不断上升,因此早期诊断心血管疾病对治疗和预后具有关键作用,传统诊断不具有特异性,而circRNA具有丰度高、稳定性好、保守性及特异性高等优点。综上所述目前已有多项研究报道,circRNA可通过作为miRNA的分子海绵,在调控许多心血管疾病诸如心肌梗死、心力衰竭、冠心病等疾病的发生发展过程中具有极其重要的临床实践价值,成为心血管疾病诊疗的新突破。circRNA有望成为新的心血管疾病诊断标志物,能够早期干预治疗,有效改善广大患者的远期预后,提高人们的生活质量。

尽管在心血管疾病患者外周血中发现了大量circRNA发生表达变化,但外周血中circRNA含量较少,PCR法因易受到外在掺杂杂质影响使定量检测准确性存疑。再者,实验中过程中事实性和可重复性分析方法、样品收集和处理、设备和程序等情况需要制定公认的circRNA识别和量化方案。除此之外,circRNA的详细降解机制是怎样的呢?有研究表明[26],通过一种称为胞外囊泡的释放实现了circRNA的清除,也可能涉及其他降解机制,这也提示研究者们circRNA与外分泌体的关系也密不可分。与此同时,circRNA在临床上的应用也有诸多困难。首先,现阶段大多数研究处于动物模型阶段,缺乏大规模临床试验数据支撑;动物模型外周血中检测到的潜在生物标志物是否可在人体中检测到,毕竟目前心血管疾病的发生还包括外界高压力环境因素导致内分泌系统方面失调,这些影响因素在动物模型中都是无法模拟的。其次,大多数心血管病人多年服用各种药物,目前没有相关研究证明这些药物是否影响潜在生物标志物的产生或转归。最后,目前研究circRNA大多聚集在单个心血管疾病,而人群患病常合并多种严重并发症,但关于研究circRNA在多种心血管疾病中的作用尚存在不足,仍需研究者进一步深入研究。作为非编码RNA家族的一员,目前对其确切分子机制及生理病理调控作用的理解还不够全面深刻,仍处于初级阶段,有待当前医疗界研究者进一步深入探索、挖掘。相信在不久的未来,随着生物医学技术的与时跟进以及研究者们的不断得深入研究,越来越多circRNA的调控机制及生物学功能研究日趋成熟,届时通过检测circRNA表达水平即可确定心血管疾病严重程度,并根据生物标志物的分子生理病理机制研发出靶向药物延缓甚至逆转疾病进展,成为未来心血管疾病的诊断和治疗的新靶点。