应用于3D 生物打印的甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶相关理化性能的研究进展

吴海媚，丁 能，朱 鴷

三维（three-dimensional，3D）生物打印技术在过去十几年里得到快速的发展，不同的打印技术日渐成熟[1]。3D 生物打印的核心是直接将负载细胞的材料打印成生物支架[2]。 它具有灵活的支架制造和再现自然组织3D 复杂结构的能力[3]。 因此，3D 生物打印技术在生物医学工程等领域被广泛应用。

生物墨水是打印的重要组成成分。明胶及其衍生物与不同类型的细胞（如成纤维细胞、间充质细胞、脂肪细胞等）及生长因子具有良好的生物相容性，是非常受欢迎的生物墨水[3]。 水凝胶是具有3D 结构的亲水聚合物， 并具有类似于细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的多孔结构，有利于细胞的黏附、增殖、迁移和分化[4]，与细胞微环境极其相似[5]。 因此常被用于3D 生物打印支架材料，其理化性质是影响打印支架的生物和力学性能的关键。理想的水凝胶要求能快速可控交联，有效促进细胞黏附、增殖分化和迁移[6]。天然来源聚合物形成的水凝胶与ECM 存在一定的相似性，可为细胞提供支架和生物行为上的支持，促进细胞增殖分化，但这类水凝胶机械性能较差，黏度较低，可打印性较差，而人工合成聚合物形成的水凝胶机械性能则更加可控[7]。 有些凝胶材料（聚乙烯醇、酸钠等）经3D 打印与ECM 存在显著的差异[8]。 甲基丙烯酸酐化明胶（gelatin methacryloyl，GelMA）水凝胶具有优良的生物相容性及易调控的机械性能，引起了众多研究人员的兴趣。 目前，用于GelMA 的生物3D 打印技术包括立体光固化打印、挤出式打印及数字光固化打印， 由于挤压成型生物打印技术具有过程可控、设备简单、耗能较少等优势，更适合打印负载细胞材料[7，9，10]，通过光交联精确地形成GelMA 3D 支架[4]。 由于GelMA 水凝胶机械性能非常弱，在3D 生物打印应用中受到一定的限制。许多研究者通过添加物质形成混合水凝胶以提升其生物和力学性能。 因此，文章对近年基于3D 生物打印的GelMA 水凝胶材料的改性进行综述。

1 GelMA 水凝胶的制备

在生物制造领域中使用的明胶主要来源于哺乳动物，含有大量精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD） 序列和基质金属蛋白酶（matrix-metalloproteinase，MMP）， 有利于细胞的黏附与重塑[3，11]。GelMA 由Van Den Bulck AI 等首次提出并制备[12]。GelMA 是通过明胶中氨基与甲基丙烯酸酐（methacrylic anhydride，MA） 在一定条件下反应得到的光敏聚合物[11]。此外，MA 的化学修饰过程涉及极少的氨基酸残基，大部分功能性氨基酸序列没有受到影响，这保证了GelMA 水凝胶良好的细胞黏附性能[13]。目前已报道很多GelMA 水凝胶的制备方法， 整个制备过程基本为先取明胶溶于（杜氏）磷酸盐缓冲溶液[Dulbecco’s phosphate-buffered saline，（D）PBS]中，根据不同的取代度， 在50 ℃环境下加入所需量的MA溶液进行反应；在相同的环境中透析4 ～7 d，以去除残留的MA 和甲基丙烯酸[4]；最后将透析液进行真空冷冻干燥获得GelMA； 取一定量的GelMA 加入无毒光引发剂（常用LAP，Irgacure 2959），经紫外线照射形成GelMA 水凝胶。

许多研究证明，MA 的取代度、 引发剂的浓度及种类，GelMA 浓度及紫外线照射时间等因素都会影响到GelMA 水凝胶的孔隙率、弹性模量、降解度和溶胀率等物理性能及生物性能[13，14]。 李媛媛等[15]通过制备不同质量浓度的GelMA 水凝胶，经分析证明，随着GelMA 的质量浓度增加，弹性模量明显增加，但材料的吸水率、溶胀率、MA 的交联率均降低，可能是因为大量引入明胶增大了空间位阻， 从而降低了交联率；同时由于结构变得更加紧密， 材料的孔隙率明显减小。 顾恒等[9]制备GelMA-明胶-海藻酸钠复合水凝胶通过紫外光照射5 min 和10 min 对比下，复合凝胶的弹性模量增加70%，但其伸长率下降。高水平交联的水凝胶可提供很好的打印形状保真度，但会降低水凝胶的溶胀比，减小孔径，减少细胞生存所需的氧气和营养物质的扩散[16]。 考虑到生物墨水中光引发剂的浓度、种类及与活细胞的长期接触，可能对细胞产生一定的影响。 Xu H 等[14]通过打印含固定细胞浓度和不同浓度的光引发剂的GelMA， 结果显示， 使用Irgacure 2959 和LAP 时， 细胞活力通常会随着光引发剂浓度和打印时间的增加而降低；虽然低浓度光引发剂有利于提高细胞活力，但可能难以完全交联；此外发现，Irgacure 2959 固化的GelMA 样品比LAP 固化的样品孔径稍大，降解速度更快，溶胀率更大。但另有研究表明，Irgacure 2595 对光敏感性较低，LAP 凝胶化速度是Irgacure 2595 的10 倍。 快速凝胶化可对负载细胞的损坏程度降到最低[17]。

2 基于GelMA 复合水凝胶研究

3D 生物打印过程的打印气压、喷头移动速度、喷头高度等工艺参数都会对打印支架产生影响[9，18]，但从材料化学改性角度来改善支架相关性能仍是研究的焦点。纯GelMA 水凝胶具有较差的力学性能，不利于进行3D 打印形成支架[9]。 对GelMA 制备过程改变某一因素提高材料的某一性能的同时，有可能会降低或破坏其他性能[13]。针对水凝胶的加工性能和生物相容性的要求往往是相反的[16]。 因此，研究人员经过不断的探索，通过引入纳米材料，天然聚合物及合成聚合物进行化学修饰以改善GelMA 材料的物理性能及材料的生物相容性能，使水凝胶同时满足相关应用功能和3D 生物打印制备需求。

2.1 纳米材料复合型

高浓度的GelMA 水凝胶刚度显著提升， 但其孔隙率的减小却显著影响了细胞活力、 增殖分化和迁移[19]。 很多研究已证明，低浓度的GelMA 具有高孔隙率，有利于细胞的增殖与营养物质的输送，但不能满足生物墨水应具有的足够流变性能标准[20]。纳米材料也是当前的研究热点， 通过在低浓度的GelMA 中掺入纳米材料， 可增强GelMA 的机械性能与打印适应性。 一些纳米材料还可为GelMA 赋予良好的导电性能，在构建3D 导电组织领域具有巨大的应用潜力。

2.1.1 纳米纤维

纳米纤维可增强水凝胶的压缩模量，可作为细胞生长胶原纤维进行设计。 纤维素纳米纤维（cellulose nanofiber，CNF） 是主要由植物纤维制备而成的纳米纤维材料，因其具备增强性能和保水性等特性而被广泛使用。Shin S 等[20]将GelMA 与CNF 溶液混合制备5种不同CNF 浓度的生物墨水，发现随着CNF 浓度的增加，GelMA 溶液的黏度逐渐增加，表现出剪切稀化行为，打印形状保真度得到提高，复合凝胶的压缩模量也得到了十几倍的增加。经过体外细胞毒性实验表明， 该复合水凝胶无细胞毒性， 细胞活性保持稳定。Cernencu AI 等[3]从鱼皮和牛皮提取明胶制备GelMA与CNF 混合， 经测试表明生物墨水的黏度和支架培养细胞的存活率均有所提高。

细菌纤维素又称微生物纤维素，相比植物纤维素具有更高的纯度，并具有良好的生物相容性和生物降解性。 细菌纳米纤维素（bacterial nanocellulose，BNC）是由相互连接的纤维素带组成[21]。Wu Z 等[21]制备含有海藻酸钠和BNC 的GelMA 复合水凝胶，可以保持支架固有的形状，具有良好的形状保真度，提高了水凝胶的压缩模量， 证实了BNC 可以作为生物墨水的机械增强剂和流变改性剂。 同时由于BNC 的多孔纳米结构和丰富的羟基官能团使其活性催化层与基底结合紧密，材料的导电性明显增强，并有效促进细胞的黏附。

2.1.2 纳米金属

许多金属纳米颗粒（金、银、氧化铁等）具有优秀的导电性，并可以提高材料的力学性能。 Boularaoui S等[22]通过制备金纳米颗粒（gold nanoparticle，AuNP）/GelMA 复合生物墨水进行机械测试，结果发现，AuNP改善了GelMA 的流变性， 同时增加了生物墨水的导电性，可为细胞提供所需电信号。此外，纳米银是一个热门的研究元素。 纳米银可以调节细菌的行为、代谢和生长，具有杰出的抗菌性能，广泛应用于水凝胶敷料领域[23]。Cao C 等[24]制备GelMA/单宁酸（tannic acid，TA）-聚磷酸盐 （polyphosphate，Poly）-银纳米颗粒（silver nanoparticles，AgNPs）复合水凝胶，证明AgNPs的引入不仅提高了GelMA 水凝胶的可受最大应力，同时提高了水凝胶的光热性能，进一步提高了水凝胶的抗菌活性， 通过控制AgNPs 的引入量使水凝胶具有良好的细胞相容性。 银纳米线 （silver nanowire，AgNW）具有优良的导电性和柔韧性，Ha JH 等[18]在GelMA/胶原蛋白复合水凝胶中引入AgNW，经过流变性能检测证明AgNW 有效提高了复合水凝胶的黏弹性机械强度。在通电下，内部离子移动，水凝胶内外之间表现出渗透压，导致质量减少，证明该复合水凝胶系统可通过收缩和膨胀过程来控制分子的释放。目前银纳米材料与GelMA 的研究虽多，但结合3D 生物打印技术的相关研究甚少，仍需要进一步的探索。

2.1.3 其他纳米材料

基于其他纳米材料复合型GelMA 水凝胶的研究很多， 比如纳米黏土和纳米羟基磷灰石（nanocrystalline hydroxyapatite powders，nHAP）等。 两者都具有良好的生物相容性等特性。纳米黏土是一种来源于天然无机矿物制成的层状硅酸盐， 厚度和直径分别为1 nm 和25 nm 的圆盘形纳米颗粒[25]。基于纳米黏土的触变性，可以容易地打印复杂的支架[26]。Gao Q 等[26]将不同浓度的纳米黏土与GelMA 混合制备的生物材料墨水，经测试表明，GelMA/纳米黏土墨水的黏度远高于纯GelMA 或纳米黏土的黏度。后续观察发现，添加纳米黏土可以提高孔隙率，降低降解率，其极限强度和压缩模量随着纳米黏土的浓度增加而增强，并证实纳米黏土有利于细胞的附着和生长。 Das S 等[27]采用水热法合成不同粒径的nHAP 粉末，以不同浓度掺入预交联的GelMA 水凝胶中，通过定制的挤出式3D 打印机进行打印。研究发现，随着nHAP 含量的增加，水凝胶的压缩模量和最大应力均增大，但由于孔隙度和孔体积降低使得水合度逐渐降低， 吸水率也逐渐降低，此外，生物酶降解速率也显著降低。

在纳米材料与水凝胶的结合研究中，获得了令人满意的结果。 材料的机械性能、3D 打印结构保真度、黏附性能等都获得显著的提升，可见纳米复合水凝胶具有很大的应用前景。但含有大量不能降解的纳米材料可能面临着细胞毒性的风险，从而限制其在体内的长期应用。

2.2 天然聚合物复合型

天然聚合物具有优异的生物相容性、生物降解性及抗菌性， 因此天然聚合物被广泛应用于伤口敷料，皮肤组织工程等领域。研究人员通过不断地探索寻找符合要求的天然聚合物来改善打印支架的相关性能，比如胶原蛋白、纤维蛋白、壳聚糖及多糖等。壳聚糖及其衍生物是近年材料研究的热门元素。壳聚糖羧甲基化不仅保留本身亲水特性，而且提高了水溶性和生物活性，并具有良好的抗菌性能[28]。 Wang L 等[28]将羧甲基壳聚糖 （carboxymethyl chitosan，CMCS） 与GelMA复合， 证明CMCS 提高了水凝胶支架的平均孔径、模量和黏度，并促进细胞的增殖和分化。

胶原蛋白是人体的主要结构蛋白， 具有高度活性、易化学修饰等优点[29]。 Stratesteffen H 等[29]将Ⅰ型胶原蛋白与GelMA 水凝胶混合， 在水凝胶中形成独特的毛细管结构，在GelMA/胶原蛋白水凝胶中，人间充质干细胞扩散增强，并随着胶原蛋白增加，水凝胶的刚度和储能模量进一步增加。 Shi Y 等[30]将掺有络氨酸酶（Ty） 的胶原蛋白与GelMA 制成新型生物墨水，经黏度测试发现，GelMA/Col-Ty 的储能模量高于GelMA/Col，并随着Ty 的浓度升高，储能模量越高。该研究表明Ty 的酶促交联可提高生物墨水的强度，但浓度太高会降低细胞活力， 经过组织学分析表明，Ty能够抑制伤口肉芽的生长，有效促进真皮的形成。 纤维蛋白加工简易， 基于纤维蛋白的水凝胶与ECM 的力学相似度高，且具有良好的细胞相容性[31]。Na K 等[10]将由蚕丝精制具有高生物相容性、出色的机械性能及不会产生免疫反应的丝素蛋白 （silk fibroin，SF）与GelMA 混合进行数字光处理（digital light processing，DLP）生物打印，使得GelMA 溶液的黏度增加约140倍，有效克服了3D 封装过程中细胞分布不均匀的缺点，但细胞真正的沉降速度仍在研究；此外，过量的SF 会降低生物墨水的可打印性。

对于来源丰富的多糖具有良好的生物活性、安全性高，且理化性能优越，在生物医学领域得到了广泛的运用[32]。 经研究将甲基丙烯修饰后得到的多糖衍生物与GelMA 混合，可有效提高打印支架的稳定性、机械性能、孔隙率和降解度，并表现出良好的生物相容性[33 ～35]。

2.3 合成聚合物复合型

合成聚合物相比天然聚合物更加稳定，并有更高的机械性能来制成某些组织支架， 应用也非常广泛。主要有聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]、聚己内酯[poly（ε-caprolactone），PCL]等高分子材料。PLGA 和PCL 是具有良好生物相容性和可降解、无毒的材料，并能够提供足够的支撑强度[36]。 Ko YG 等[37]设计含有聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米片[poly（lactic-co-glycolic acid）nanofiber fragments，PLGA-NF] 的GelMA 混合水凝胶， 研究发现PLGA-NF 的加入使水凝胶黏度和压缩模量显著增加，也有效促进了负载细胞的增殖。Buyuksungur S 等[38]通过3D 打印具有高机械强度的PCL/GelMA 复合水凝胶支架， 并对负载牙髓干细胞的PCL/GelMA 复合水凝胶进行3D 生物打印，支架中细胞表现出高活力（74%～95%）。

有些合成聚合物不但可以提升打印支架的机械性能， 并可赋予水凝胶本身极其微弱的导电性能。Spencer AR 等[39]开发了聚（3，4-乙烯二氧噻吩）-聚苯乙烯碳酸钠[poly （3，4-ethylenedioxythiophene）/poly（styrenesulfonate），PEDOT/PSS]/GelMA 水凝胶， 通过控制PEDOT/PSS 的浓度来调节电导率， 可打印生成高分辨率和打印保真度的3D 仿生结构。

合成聚合物具有可控稳定的结构，使其在提高材料性能方面比天然聚合物更占据优势。如今众多合成聚合物复合水凝胶已被研究出来，不仅为了提供高材料的力学性能，同时赋予材料多样其他性能，如药物控释、光敏性、热敏性等，得到更广泛的应用。

3 总结与展望

理想的水凝胶支架不仅要具备良好的机械性能，还需根据不同的负载细胞，控制好支架的孔径，具有良好的生物相容性。 GelMA 因其本身所具有的优良特性， 在生物医学应用领域成为非常受欢迎的材料。低浓度的GelMA 具备高生物相容性， 但其机械性能较差，所得支架并不能满足设计需求，并成为打印过程重大的挑战。 通过不断探索复合天然/合成聚合物的混合水凝胶，可大大提升支架的机械性能，同时保留GelMA 优越的生物相容性。 而纳米材料同时增强了GelMA 水凝胶的电导率， 不仅可以调控细胞的行为， 并可结合柔性电子及图像处理等电子信息技术，将支架实现智能功能，尤其是在敷料支架领域的研究极其热门。