循环肿瘤细胞与循环肿瘤微栓在鼻咽癌中的表达及其临床意义

周龙清，喻国冻，张 瑜

（1.贵州医科大学附属肿瘤医院耳鼻咽喉头颈外科；2.贵州医科大学附属医院耳鼻咽喉头颈外科，贵州 贵阳 550004）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）是指原发于鼻咽部黏膜上皮的恶性肿瘤，多发生于鼻咽顶壁和内侧，尤其是咽隐窝，其发生率主要与病毒感染、遗传、环境等因素有关，是耳鼻喉科头颈肿瘤疾病中常见的恶性肿瘤之一。多数NPC 患者以颈部出现肿块为首发症状，由于NPC 早期症状不明显，多数患者确诊时已进入进展期或晚期。目前，EB 病毒血清抗体标志物与血浆EB 病毒DNA（EBV-DNA）检测均可用于NPC 的早期筛查，但其特异度较低，且影像学检查也存在一定局限性[1]。循环肿瘤细胞（CTCs）是一种新兴的肿瘤特异性生物标志物，是指由肿瘤原发灶或转移灶脱落进入血液循环系统的肿瘤细胞，在胃癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等恶性肿瘤的诊断、治疗及预后监测中逐渐被临床应用和推广[2]。研究指出，部分CTCs 可逃离机体免疫识别或药物治疗，在体内寻找合适的微环境，形成“种子”在远端组织器官或原发组织种植生长，导致肿瘤的转移或复发[3]。循环肿瘤微栓（CTM）是指多个CTCs 同类聚集或与其他种类细胞聚集形成的细胞团，在血液中，CTM 会减缓血流速度，可成为血液中凝血酶形成的平台，形成血栓栓塞[4]。相比单个形式存在的CTCs，CTM 更易避免肿瘤细胞凋亡，且更易发生免疫逃逸，生存力更强，放化疗耐受性更好，转移风险更高[5]。目前CTCs 与CTM 在NPC 患者中的临床研究报道较少。因此，本研究旨在探讨CTCs 与CTM 在NPC 中的表达及其临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料回顾性分析2020 年8 月至2021 年8 月贵州医科大学附属肿瘤医院收治的122 例疑似NPC 患者的临床资料，按病理学检查结果的不同分为鼻咽部慢性炎症组（30 例）与NPC 组（92 例）。鼻咽部慢性炎症组患者中男性15 例，女性15 例；年龄18～63 岁，平均（46.56±5.86）岁。 NPC 组患者中男性48 例，女性44 例；年龄22～75 岁，平均（48.52±7.79）岁。诊断标准：参照《实用耳鼻咽喉头颈外科学》[6]中的相关诊断标准。纳入标准：①符合上述诊断标准且经常规病理检查确诊；②未接受相关化疗与靶向治疗等抗肿瘤治疗；③临床资料完整。排除标准：①合并免疫疾系统疾病；②进行放化疗和（或）生物靶向治疗；③长期使用非甾体类抗炎类药物。本研究经贵州医科大学附属肿瘤医院医学伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 病理学检测和分型 取所有患者组织样本，均使用10%福尔马林进行固定并石蜡包埋切片后，经病理科诊断疾病类型，并进行病理分型。

1.2.2 外周血CTCs 与CTM 的检测 采用CTC-Biopsy®系统检测所有患者外周血CTCs 与CTM 情况，采集所有患者外周静脉血约8 mL，其中5 mL 立即置于抗凝真空采血管并轻柔颠倒混匀8 次以避免凝血，采用3 mL 0.2%的多聚甲醛缓冲液进行稀释，室温下静置10 min 后经直径为8 μm 的圆孔膜过滤，分离并富集CTCs，用Diff-Quick染色富集到的CTCs，风干并封片。处理样本要求：血液样本需在2 h 内完成检测，若不能在2 h 内进行检测，则需竖直静置于4 °C 冰箱保存，保存时间不能超过24 h，处理前至少在室温环境复温30 min。 CTCs 判定标准[7]：细胞核不规则，呈现杆状、分叶状、马蹄形状、肾形、卵圆形状；核质比大于0.8；核直径大于15 μm；核仁突出、深染且着色不均匀；核膜增厚出现凹陷或皱褶，核膜呈锯齿状；细胞核染色质边移或巨大核仁、异常核分裂。CTM 判定标准：3 个及3 个以上的CTCs 成团[7]。所有患者CTCs、CTM 结果的判定均由3 名资深细胞病理学家在不了解患者临床资料和病理诊断的情况下独立评估和判读。

1.2.3 NPC 患者EBV 感染情况 将1.2.2 中采集的剩余3 mL 外周静脉血采用荧光定量聚合酶分析法检测NPC 患者EBV-DNA 感染情况，以拷贝数＞500 拷贝/mL 计为阳性[8]。

1.3 观察指标①比较两组患者CTCs 阳性率与CTM 阳性率。②比较NPC 组CTCs、CTM 阳性和阴性患者的临床特征，收集所有患者性别、年龄、病理类型、T 分期、N 分期、临床分期、EBV-DNA，并进行分析。T 分期标准：TX为原发肿瘤无法评价；T0为无原发肿瘤存在证据，包含颈部淋巴结EBV 阳性；T1为肿瘤局限于鼻咽部，或侵犯口咽和（或）鼻腔；T2为肿瘤侵犯咽旁间隙，和（或）邻近软组织（包括翼内肌、翼外肌、椎前肌）；T3为肿瘤侵犯颅底、颈椎、翼状结构，和（或）鼻旁窦；T4为肿瘤颅内侵犯，侵犯颅神经、下咽部、眼眶、腮腺和（或）翼外肌侧缘软组织浸润。N 分期标准：NX 为区域淋巴结无法评价；N0无区域淋巴结转移；N1为单侧颈部淋巴结转移，和（或）单侧、双侧咽后淋巴结转移，转移灶最大径≤ 6 cm，在环状软骨下缘以上；N2为双侧颈部淋巴结转移，转移灶最大径≤ 6 cm，在环状软骨下缘以上；N3为单侧或双侧颈部淋巴结转移，转移灶最大径＞6 cm，和（或）侵犯超过环状软骨下缘[8]。③相关性。采用Spearman 相关系数法分析NPC 患者CTCs、CTM 阳性率与N 分期、EBV-DNA的相关性。

1.4 统计学方法采用SPSS 23.0 统计学软件分析数据，计数资料以[ 例(%)]表示，采用χ2检验；采用Spearman相关系数法分析NPC 患者CTCs、CTM 阳性率与N 分期、EBV-DNA 的相关性。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者CTCs 和CTM 的表达差异NPC 患者 CTCs 染色可见核型异常，胞核呈分叶状，见图1， CTCs阳性率67.39%（62/92），高于鼻咽部慢性炎症组中CTCs阳性率为0.00%（0/30），差异有统计学意义（χ2=41.109，P＜0.05）。 NPC 患者CTM 染色可见存在3 个和3 个以上CTC 构成的小细胞团，见图2，CTM 阳性率为56.52%（52/92），高于鼻咽部慢性炎症组中CTM 阳性率0.00%（0/30），差异有统计学意义（χ2=29.553，P＜0.05）。

图1 NPC 患者CTCs（40×）

图2 NPC 患者CTM（40×）

2.2 NPC 组CTCs 阳性和阴性患者临床特征分析NPC组患者中， CTCs 阳性患者N2～N3期占比高于CTCs 阴性，EBV-DNA 阳性患者占比高于CTCs 阴性，差异均有统计学意义（均P＜0.05）； NPC CTCs 阳性和阴性患者在性别、年龄、病理类型、T 分期、临床分期方面比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 NPC 组CTCs 阳性和阴性患者临床特征分析[ 例(%)]

2.3 NPC 组CTM 阳性和阴性患者临床特征分析NPC组患者中，CTM 阳性患者N2～N3期占比高于CTCs 阴性，EBV-DNA 阳性患者占比高于CTCs 阴性，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；NPC CTM 阳性和阴性患者在性别、年龄、病理类型、T 分期、临床分期方面比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

表2 NPC 组CTM 阳性和阴性患者临床特征分析[ 例(%)]

2.4 相关性经Spearman 相关性分析显示，NPC 患者CTCs 阳性与N 分期、EBV-DNA 阳性均呈正相关（r=0.259、0.232）；NPC 患者CTM 阳性与N 分期、EBV-DNA 阳性均呈正相关（r=0.247、0.337），差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3。

表3 NPC 患者CTCs、CTM 阳性率与N 分期、EBV-DNA 的相关性分析

3 讨论

NPC 是一种对放射敏感性的肿瘤，由于其解剖位置特殊，早期缺乏特异性症状与有效的诊断方法，从而不易被诊断。早诊断、早治疗是降低NPC 患者病死率、提高生存率的关键。传统肿瘤疾病主要通过组织活检和影像学检查结果进行诊断。影像学检查只能发现直径＞5 mm 的肿瘤，对微小瘤体诊断的准确率较低[9]。在肿瘤的形成、发展过程中，部分肿瘤细胞由原发灶或转移灶脱落进入外周血液，因此，外周血CTCs 的检测可有效用于体外早期诊断，与传统组织病理活检相比，CTCs 检测具有无创、便捷等优点，目前已被广泛应用于肿瘤疾病的诊断与患者的预后评估[10]。

CTCs 在NPC 患者疾病进展过程的各个阶段表达不同，因此检测外周血中的CTCs 对鼻咽癌的早期筛查与诊断均具有积极作用[11]。CTCs 具有不同的细胞表型，包括上皮细胞型CTCs、上皮与间质细胞混合型CTCs 和间质细胞型CTCs，细胞表型可有效反映肿瘤细胞的恶性程度，其中间质细胞型CTCs 较其他表型CTCs 具有更强的迁移和侵袭能力[12]。CTCs 以不同形态存在于外周血，3 个及3 个以上CTCs 构成的细胞簇称为CTM，在恶性肿瘤的转移中具有重要作用，且CTM 比CTC 更具侵袭性、转移潜能及对凋亡的抵抗力[13]。本研究结果显示，鼻咽部慢性炎症患者外周血液中均未检测到CTCs 与CTM，NPC 患者CTCs 阳性率为67.39%，CTM 阳性率为56.52%，与吴君心等[14]研究结果一致。

本研究进一步对患者的临床特征资料分析，结果显示，NPC 患者中，CTCs、CTM 阳性患者N2～N3期占比高于阴性患者，EBV-DNA 阳性患者占比高于阴性患者，提示NPC 患者外周血中CTCs、CTM 阳性均与患者N 分期、EBV-DNA 密切相关，NPC 患者中N 分期越高且EBV-DNA阳性的患者有较高的CTCs 和CTM 阳性率。T、N 分期是影响NPC 患者治疗的重要因素，目前临床主要通过影像学技术对NPC 患者诊断与T、N 分期进行判定，但影像学的迟滞性和不稳定性导致不能对NPC 的疗效及时评估[15]。CTCs 检测在NPC 患者的诊断与临床分期中具有一定优势，可避免组织病理学和影像学检测的局限性，同时能反映肿瘤整体异质性的特征，尤其是对于已发生转移的患者[16]。肿瘤在无淋巴结和远处转移时，可在外周血液循环中检测到CTCs，因其从原发灶脱落，通过侵袭、迁移和入侵血管等方式进入血液循环，极易通过血液循环而转移到全身其他器官，因而可通过检测外周血中CTCs 了解患者病情恶化、转移情况[17]。

在NPC 的发生发展中，CTCs 和EB 病毒的活化状态受环境因素的影响，且放化疗等抗肿瘤治疗也将影响CTCs与EB 病毒的相互作用。EB 病毒对NPC 患者的诊断、复发、转移的检测具有重要意义，外周血中CTCs 数量与EB病毒的载量呈正相关，EB 病毒的负荷越大，外周血中检测出的CTCs 数量则越多[18]。本研究中，经Spearman 相关性分析显示，NPC 患者CTCs 阳性率与N 分期、EBV-DNA阳性均呈正相关（r=0.259、0.232）；NPC 患者CTM 阳性率与N 分期、EBV-DNA 阳性均呈正相关（r=0.247、0.337），说明NPC 患者与EB 病毒感染高度相关，外周血中CTM阳性，则肿瘤恶化、复发、转移的可能性较高。

综上，NPC 患者外周血中CTCs 阳性与N 分期及EBV-DNA 密切相关，CTM 阳性与N 分期、EBV-DNA 密切相关，CTCs 和CTM 可作为NPC 早期诊断和预后的辅助评价指标。