次氯酸消毒液对伪狂犬病病毒核酸降解作用及其消毒效果评价

丘富安 王 涛 廖维连 陈仕雄 秦 韬*

(1 福州中科基因技术有限公司，福建福州 350000；2 福建农林大学，福建福州 350000；3 将乐县动物疫病预防控制中心，福建三明 353300）

伪狂犬病病毒在世界多国猪场都有广泛的感染，早在1902年匈牙利微生物学家就关注并描述了该病。伪狂犬病是由疱疹病毒科的伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的仔猪神经症状，成年猪呼吸道症状以及种母猪咳嗽、发烧、流产、产木乃伊胎、产死胎等繁殖障碍，种公猪睾丸肿胀和种用性能降低等症状。由于伪狂犬病病毒对我国的生猪养殖业产生了巨大的影响[1]，早在2012年原农业部印发的关于《2012年国家动物疫病监测计划》通知中对伪狂犬病净化做出指导，也对畜牧业的生物安全和防疫意识方面带来促进和变革[2]。伪狂犬病病毒会通过鼻液、唾液、乳汁、阴道分泌液、血液及实质性器官等进行排毒传播，所以消毒是养猪场做到伪狂犬病净化的关键措施之一，最常用的消毒方法有生物、化学和物理消毒法。化学消毒法具有获取简单、经济方便、作用速度快、杀菌谱广等优势被猪场应用在防控和饲养管理的各个环节中。目前，化学消毒剂（含氯类、过氧化物类、醛类、醇类、含碘类、酚类、双胍类和季铵盐类消毒剂等）市场种类较多，各类消毒剂理化性质不一，实际消毒现场环境干扰因素繁多[3,4]。

在疫病日常监测中，采用的荧光PCR 法具有方便、快捷、价格低廉等优点被广大养殖户所应用[5]，也是临床检测伪狂犬病病毒最为常用的方法之一，所以应用荧光PCR 法检测消毒后的核酸残留能够大量、快速且多维度去评价消毒剂的效果。本试验使用伪狂犬病病毒作为研究对象，采用荧光PCR 检测技术，探索有效消毒产品在不同的消毒剂浓度、消毒时间、消毒温度以及模拟不同的消毒场景下对病毒核酸降解效果，为养殖场的疫病净化和防疫消毒提供了科学理论基础。

1 材料及仪器

1.1 试验材料

次氯酸消毒液，有效含量：500 ppm，购自江苏某生物科技有限公司。猪伪狂犬病病毒阳性组织研磨液（福州中科基因技术有限公司检测Ct 值为26.31）。注射器、伪狂犬病病毒核酸荧光PCR 检测试剂盒由广州维伯鑫生物科技有限公司生产。核酸提取试剂盒由济凡生物科技(常州)有限公司生产。PBS 缓冲液、5 mL 离心管、50 mL 离心管、棉签由北京兰杰柯科技有限公司生产。20 cm×27 cm×4.8 cm 不锈钢方盘由佛山市金骏宝不锈钢有限公司生产。各种消毒剂，均购于国内知名厂家，合格产品，现配现用。

1.2 试验仪器

荧光定量PCR 仪购自杭州朗基科学仪器有限公司，全自动核酸提取仪购自济凡生物科技(常州)有限公司，离心机购自湖南湘仪离心机仪器有限公司。

2 试验方法

2.1 不同消毒方式对伪狂犬病病毒核酸降解作用

将猪伪狂犬病病毒组织研磨液涂抹于洁净的不锈钢方盘内，涂抹面积为10 cm×10 cm（如图1）。待表面风干后，分别加入75%酒精、3% NaOH、6% NaOH、3%碘伏、0.5%过硫酸氢钾、10%二氯异氰尿酸钠、3%过氧化氢、3%二氧化氯、0.05%苯扎溴铵、60 ppm 次氯酸、2%戊二醛、1%过氧乙酸消毒液（均为说明书建议现场消毒常用浓度）倒入不锈钢方盘内，然后于室温下静置反应30 min。同时设置用涂抹猪伪狂犬病病毒阳性组织研磨液的不锈钢方盘在臭氧、高温高压（70℃、90℃、120℃、150℃），以及紫外灯照射消毒环境下，消毒时间均为30 min（紫外灯照射设置30 min 和2 h），另设纯净水组作为对照。消毒结束后，使用棉签对不锈钢方盘底部采样并用1 mL 无菌生理盐水对棉签浸泡，最后对收集的洗脱液进行伪狂犬病病毒核酸检测，比较常用的消毒方式之间的消毒效果。

图1 猪伪狂犬病病毒阳性组织研磨液涂抹方法和用于试验的不锈钢方盘

2.2 不同温度、不同时间、不同浓度次氯酸消毒液对伪狂犬病病毒核酸降解作用

常温（21℃左右）条件下，将等量的猪伪狂犬病病毒阳性组织研磨液均匀涂抹于洁净的不锈钢方盘内，涂抹面积为10 cm×10 cm。待表面风干后，分别取50 mL 的7.5、15、30、60 ppm 次氯酸消毒液倒入不锈钢方盘内，然后于室温下静置10、15、30、45 min（详见表1），计时结束立即加入10 g/L 的硫代硫酸钠溶液50 mL，终止反应1 min 后，倒去不锈钢方盘内液体并竖立晾干，使用棉签对不锈钢方盘底部采样并用1 mL无菌生理盐水对棉签浸泡，最后对收集的洗脱液进行伪狂犬病病毒核酸检测。低温（4℃左右）条件下的试验方法与常温条件下的方法一致。

表1 不同消毒方式对伪狂犬病病毒核酸降解作用

2.3 消毒方式作用试验

2.3.1 浸泡组

将等量的猪伪狂犬病病毒阳性组织研磨液均匀涂抹于洁净的不锈钢方盘内，涂抹面积为10 cm×10 cm。待表面风干后，分别取50 mL 的60 ppm 次氯酸消毒液倒入不锈钢方盘内，然后于室温下静置10、15、30、45 min，计时结束立即加入10 g/L 的硫代硫酸钠溶液50 mL 终止反应，1 min 后倒去不锈钢方盘内液体并竖立晾干，使用棉签对不锈钢方盘底部采样并用1 mL 无菌生理盐水对棉签浸泡，最后对收集的洗脱液进行伪狂犬病病毒核酸检测。

2.3.2 喷雾组

将等量的猪伪狂犬病病毒阳性组织研磨液均匀涂抹于洁净的不锈钢方盘内，涂抹面积为10 cm×10 cm。待表面风干后，使用喷壶装置60 ppm 次氯酸消毒液喷洒于不锈钢方盘内，喷雾至雾滴形成单层致密排列即可。然后于室温下静置10、15、30、45 min，计时结束立即加入10g/L 的硫代硫酸钠溶液50 mL，终止反应1 min 后倒去不锈钢方盘内液体并竖立晾干，使用棉签对不锈钢方盘底部采样并用1mL 无菌生理盐水对棉签浸泡，最后对收集的洗脱液进行伪狂犬病病毒核酸检测。

2.3.3 擦拭组

将等量的猪伪狂犬病病毒阳性组织研磨液均匀涂抹于洁净的不锈钢方盘内，涂抹面积为10 cm×10 cm。待表面风干后，使用60 ppm 次氯酸消毒液浸湿的纱布来回重压擦拭不锈钢方盘2、5、20、50 次。使用棉签对不锈钢方盘底部采样并用1 mL 无菌生理盐水对棉签浸泡，最后对收集的洗脱液进行伪狂犬病病毒核酸检测。

2.3.4 高压冲洗组

将等量的猪伪狂犬病病毒阳性组织研磨液均匀涂抹于洁净的不锈钢方盘内，涂抹面积为10 cm×10 cm。待表面风干后，使用冲牙器装置60 ppm 次氯酸消毒液连续冲洗不锈钢方盘内部，冲洗时间为1、2、5、10 min，计时结束立即加入10 g/L 的硫代硫酸钠溶液50 mL 终止反应1 min 后倒去不锈钢方盘内液体并竖立晾干，使用棉签对不锈钢方盘底部采样并用1 mL 无菌生理盐水对棉签浸泡，最后对收集的洗脱液进行伪狂犬病病毒核酸检测。

2.4 不同物资消毒效果

将猪伪狂犬病病毒阳性组织研磨液均匀涂抹于常见的猪场物资如不锈钢、塑料瓶、塑料袋、编织袋、疫苗瓶、水泥地、瓷砖、报纸、衣服、鸡蛋壳、泡面、青菜、轮胎、木板等表面。待表面风干后，取足够的60 ppm次氯酸消毒液浸泡20 min，计时结束立即加入10 g/L 的硫代硫酸钠溶液终止反应1 min 后使用棉签对不锈钢方盘底部采样并用1 mL 无菌生理盐水对棉签浸泡，最后对收集的洗脱液进行伪狂犬病病毒核酸检测。

2.5 结果判定

试验成立条件：阴性对照无Ct 值，无明显指数增长期和平台期。阳性对照FAM 通道Ct 值≤30，有明显指数增长，呈典型的“S 形”曲线。

判定标准：样品检测Ct 值小于40 判定为阳性，呈典型的“S 形”曲线。

3 结果和分析

3.1 不同消毒方式对伪狂犬病病毒核酸降解作用

对75%酒精、3% NaOH、6% NaOH、3%碘伏、0.5%过硫酸氢钾、10%二氯异氰尿酸钠、3%过氧化氢、3%二氧化氯、0.05%苯扎溴铵、60 ppm 次氯酸、2%戊二醛、1%过氧乙酸消毒液和臭氧、高温高压、紫外光进行伪狂犬病毒核酸降解作用试验，结果可知（见表1），60 ppm 次氯酸组和紫外光2 h 组为阴性。说明在30 min 消毒时间内，测试组中只有60 ppm 的次氯酸消毒液具很好地降解伪狂犬病病毒核酸的作用。此外，紫外光照射30 min 未能完全降解猪伪狂犬病病毒阳性组织研磨液内的核酸，至少需要2 h 才可完成核酸降解。

3.2 常温下不同时间、不同浓度的次氯酸消毒液对伪狂犬病病毒核酸降解作用

由结果可知（见表2），所有≥30 ppm 组和15 ppm、45 min 组结果为阴性。说明在常温环境下，消毒时间、消毒浓度与核酸的降解效果呈现明显的正相关，并且次氯酸消毒剂浓度≥30 ppm 和消毒时间≥10 min，对猪伪狂犬病病毒阳性组织研磨液内的核酸均有很好的降解作用。此外，浓度为15 ppm 次氯酸消毒剂在消毒时间≥45 min 时也能完全降解猪伪狂犬病病毒核酸。

表2 常温下不同时间、不同浓度的次氯酸消毒液对伪狂犬病病毒核酸降解作用

3.3 低温下不同时间、不同浓度的次氯酸消毒液对伪狂犬病病毒核酸降解作用

由结果可知（见表3），所有≥30 ppm 组结果均为阴性。说明在4℃环境下，消毒时间、消毒浓度与核酸的降解效果呈明显的正相关，并且次氯酸消毒剂浓度≥30 ppm 和消毒时间≥10 min，对猪伪狂犬病病毒阳性组织研磨液内的核酸均有很好的降解作用。且低温环境下，相同时间，相同浓度的实验组Ct 值都会比常温下的Ct 值低。说明低温对次氯酸消毒剂有一定抑制影响。

表3 低温下不同时间、不同浓度的次氯酸消毒液对伪狂犬病病毒核酸降解作用

3.4 消毒方式作用试验

由表4 可知，所有浸泡组、高压组、喷雾45 min组、擦拭20 次组、擦拭50 次组均为阴性，说明消毒方式采用浸泡和高压冲洗且消毒时间≥10 min，对猪伪狂犬病病毒阳性组织研磨液内的核酸均有很好的降解作用。来回重压擦拭≥20 次或喷雾消毒超过45 min 也能够降解伪狂犬病病毒核酸。

表4 消毒方式作用试验

3.5 不同物资表面消毒效果

针对涂抹了猪伪狂犬病病毒阳性组织研磨液的猪场常见物资如不锈钢、塑料瓶、塑料袋、编织袋、疫苗瓶、水泥地、瓷砖、报纸、衣服、鸡蛋壳、泡面、青菜、轮胎、木板等采用次氯酸消毒，结果显示，每个试验组的猪伪狂犬病病毒核酸检测均为阴性，说明60 ppm 次氯酸消毒液消毒20 min 能有效降解这些物资表面的猪伪狂犬病病毒核酸。

4 讨论

猪伪狂犬病危害整个养猪业，在2011年伪狂犬病病毒的变异毒株席卷全国，其蔓延速度和危害都令人畏惧，给整个国家的相关产业、贸易以及社会就业、人民收入、肉食品供应和食品安全等诸多方面带来严重影响[6,7]。

在伪狂犬病的净化道路上，国内外众多学者前赴后继总结出很多净化的方案，荧光PCR 法成为最常用的猪伪狂犬病病毒的监测手段之一。检测和消毒在伪狂犬病病毒的净化中均扮演着十分重要的角色，消毒是生物安全的重要组成部分，影响消毒效果的主要因素有消毒剂的浓度、消毒剂使用的时间、消毒剂的温度、环境中有机物的存在以及微生物的敏感性等[8,9]。为了能够有效地指导养殖者消毒，本试验用猪场常用的各类消毒剂按说明书配置消毒浓度，使用的消毒剂有75%酒精、3% NaOH、6% NaOH、3%碘伏、0.5%过硫酸氢钾、10%二氯异氰尿酸钠、3%过氧化氢、3%二氧化氯、0.05%苯扎溴铵、60 ppm 次氯酸、2%戊二醛、1%过氧乙酸消毒液等，并使用猪场常用的其他消毒手段如臭氧、高温高压、紫外光进行研究，试验采用猪伪狂犬病病毒作为被消毒对象，消毒时间为30 min，因为在日常消毒工作中，没有过多的消毒等待时间，所以能在短时间降解核酸的消毒方式才更加能够受到养殖者的青睐。本试验结果进一步说明次氯酸消毒剂降解核酸能力较突出。此外，试验模拟了不同消毒时间、消毒浓度、消毒方式和不同物资表面进行消毒效果评价，结果发现，常温环境，次氯酸消毒剂浓度≥30 ppm 和消毒时间≥10 min均能有效降解猪伪狂犬病毒核酸。但是4℃环境相比常温环境，相同消毒时间，相同次氯酸浓度的试验组Ct 值都会比常温下的Ct 值低，说明低温对次氯酸消毒剂有一定抑制影响。养殖场在冬季应谨慎使用，消毒时可选在中午温度高于4℃且提高消毒浓度和消毒时间则可保证消毒效果。周德刚[10]建议了养殖场选择消毒剂和如何使用次氯酸消毒剂，为养殖场科学消毒奠定理论基础。根据在消毒方式和不同物资表面的消毒试验，建议养殖者在消毒时采用浸泡和高压冲洗有利于病毒核酸降解，且次氯酸对核酸降解效果适用于常见的物资表面。

在伪狂犬病净化政策推动中，农业农村部将对伪狂犬病的净化工作做出进一步的指导，对消毒等生物安全措施都有提及。未来，动物疫病的防控仍然很严峻，动物疫病的净化之路也会是漫长的。次氯酸消毒剂对严重困扰养殖业的非洲猪瘟病毒（同为含囊膜的DNA 病毒）消杀效果值得学者们关注，此外，猪繁殖与呼吸综合征、流行性腹泻病和寄生虫病等比较常见且难解决的动物疫病敏感性也需要进一步验证，让养殖者能够提高防疫能力，确保场内生物安全。