燕麦苗期性状对低氮胁迫的响应及耐低氮种质筛选

赵继秀，马 祥，琚泽亮，刘凯强，何纪桐，马小龙，贾志锋

（青海大学畜牧兽医科学院, 青海 西宁 810016）

氮素是植物生长过程中必需的营养元素之一[1]，加大氮肥投入普遍成为人们发展农业生产的主要方法[2-3]。随着农牧业生产规模的扩大，国内化肥施用量也在逐年增加，而作物真正能够利用的氮肥只有少部分，绝大部分氮肥依旧存留在土壤中，并随着水土流失进入江河湖海[4]，进而引发土壤酸化、温室效应和水体富营养化等一系列环境问题[5-6]。这一环境代价已经被广泛关注，学者们相继尝试在不影响作物产量的情况下，适当减少氮肥用量，这一措施在小麦(Triticum aestivum)[7]、玉米(Zea mays)[8]、水稻(Oryza sativa)[9]等作物上取得了一定的成效，但上述研究为仅1 年田间试验结果。宫亮等[10]长期定位减施氮肥对水稻(Oryza sativa)产量的影响，发现长期减氮，水稻产量存在下降的风险。对此，研究者考虑从作物自身的基因型出发，筛选耐低氮种质，在最大程度上节约资源，实现氮高效利用。

筛选耐低氮种质是作物耐低氮育种工作的前提，而耐低氮种质的确定离不开适宜的筛选指标[11]。目前，已在玉米、棉花(Gossypium hirsutum)、谷子(Setaria italica)、小麦等作物上开展有关耐低氮性的研究。李强等[12]以叶面积、地上部干重和根体积等7 个性状作为评价玉米苗期耐低氮能力的指标，并筛选出了2 个耐低氮品种。王准等[13]以总干物质质量、地上部干物质质量和根干物质质量等6 个性状作为棉花苗期氮效率评价指标，筛选出了2 个耐低氮品种。连盈等[11]以植株苗高、生物量、氮累积量和SPAD 值(soil and plant analyzer develotrnent)等为筛选指标，选出3 个耐低氮谷子品种。李俊杰等[14]以小麦幼苗生长发育性状以及根系形态筛选出了5 份耐低氮型小麦。以上研究表明不同作物低氮耐受性的评价指标不同。

目前有关燕麦(Avena sativa)耐低氮性的研究较少。苗玉红等[15]采用土壤盆栽法探索了24 个燕麦品种在常规氮和低氮条件下的生长特性，并通过成熟期的生物量和氮积累量指标筛选出了4 份耐低氮品种。然而采用土培法筛选耐低氮种质存在一定的局限性，如土壤环境复杂，存在肥力不均、难以准确控制氮素、试验重复性差等问题[16-17]。水培试验能够避免以上问题[18]，不足之处在于水培法只能观测作物苗期的生长状况，不利于进行整个生育期的探索。但有研究表明，作物苗期的耐低氮性在一定程度上能够代表其成熟期的耐低氮性[18-19]。因此，本研究采用苗期水培方法，设置低氮胁迫和常规氮两个处理，分析燕麦幼苗农艺性状以及根系形态指标对氮素的响应，筛选不同耐低氮性燕麦种质材料，明确评价燕麦耐低氮能力的指标，旨在为燕麦耐低氮育种工作提供材料，为燕麦耐低氮胁迫分子生理机制研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2020 年种植来自中国农业科学院的139 份燕麦种质资源，通过对考种指标的筛选和聚类分析，初步得出了19 份表现较好的材料，包括7 份裸燕麦：ZY000090、ZY000150、ZY000304、ZY004071、ZY004080、ZY004085、ZY004093 ，12 份 皮 燕 麦：ZY003178、ZY004058、ZY004066、ZY004067、ZY004068、ZY004070、ZY004101、ZY004104、ZY004105、ZY004106、ZY004108和ZY004109。为探究上述田间表现良好的19 份燕麦材料是否同时具备耐低氮能力，试验将对其开展耐低氮性研究。

1.2 试验设计

1.2.1 初筛试验

燕麦种子用2% NaClO 溶液消毒10 min，用蒸馏水冲洗干净，放至湿润滤纸待其发芽。6 d 后，挑选长势一致的燕麦幼苗，用海绵条包裹采用漂浮育苗方式，移入打孔的泡沫板中，每块泡沫板平均分布24 个孔(4 × 6)，每孔种植1 株燕麦苗。试验温度控制在20～25 ℃，昼夜16 h/8 h 给予光照，每间隔1 h使用充气泵通气培养，每5 d 更换一次营养液。每份种质在各处理下设3 组重复。幼苗在装有蒸馏水的水培箱中培养2 d 后进行营养液处理，12 d 后取样并测定生物量。营养液配方参考Khan 等[20]的方法，设常 规 氮(2 mmol·L-1NH4NO3) 和 低 氮(0.2 mmol·L-1NH4NO3) 2 个处理。正常营养液配方如表1 所列。

表1 常规营养液配方Table 1 Formula of normal nutrient solution

1.2.2 复筛试验

将常规和低氮处理时间延长为18 d，其余试验方法与步骤同初筛试验。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 株高与叶绿素含量

复筛时，每个重复选取3 株燕麦幼苗，使用便携式叶绿素仪(SPAD-502)测定燕麦幼苗顶端第二片完全展开叶的SPAD 值；使用直尺测量幼苗株高。

1.3.2 生物量

初筛时，每个重复选取3 株燕麦幼苗，并将其从水培箱完整取出，将茎叶和根分开装在信封袋中，在105 ℃烘箱中杀青30 min，调至60 ℃烘干至恒重，并称重，获得茎叶干重和根干重，计算植株干重。复筛时，按照初筛时的方法称量每份种质的茎叶干重和根干重，并计算植株干重与根冠比。

植株干重 = 茎叶干重 + 根干重；

根冠比 = 茎叶干重/根干重。

1.3.3 根系形态参数

复筛时，每个重复选取3 株燕麦幼苗，将根系从幼苗分离，用蒸馏水冲洗干净，放入透明根盘中，将侧根逐一分开，用WinRHIZO 根系分析系统获取根体积、根表面积和根直径和根尖数，并用直尺测量最大根长。

1.4 综合评价值的计算

式中：Rx表示各性状的耐低氮系数；aij为各性状耐低氮系数的特征值对应的特征向量，Xij为各性状耐低氮系数的标准化值[21]；Xj表示第j个综合指标，Xjmax和Xjmin分别表示j个综合指标的最大值和最小值；U(Xj) 表示某材料第j 个综合指标隶属函数值；Wj表示第j个综合指标的权重，Pj为第j个综合指标的方差贡献率[22]；D为综合评价值。

1.5 统计分析

采用Excel 2020 对所测数据进行整理及相关数据的初步计算；使用SPSS 21.0 进行方差分析和主成分分析；通过SPSS 系统聚类分析法绘制树状图。

2 结果与分析

2.1 不同氮处理下燕麦种质生物量差异

燕麦幼苗茎叶干重、根干重和植株干重在两种氮处理下存在显著差异(P＜ 0.05) (表2)，茎叶干重和植株干重在常规氮处理下显著高于低氮处理，根干重在低氮处理下显著高于常规氮处理。不同燕麦种质茎叶干重、根干重和植株干重变异系数在低氮处理条件下分别达到23.102%、21.352%和21.063%，在常规氮处理条件下分别为20.037%、24.686%和18.162%，表明不同燕麦种质的生物量在两种氮处理下均存在较大差异。

表2 19 份燕麦种质在两种氮水平下苗期生物量差异Table 2 Differences in seedling biomass of 19 oat germplasms under two nitrogen conditions

比较各种质耐低氮系数(表3)，以综合耐低氮系数大于1.00 为标准，初步筛选出5 份耐低氮材料ZY003178、ZY004085 、ZY004067 、ZY004068 和ZY004071，以综合耐低氮系数小于0.70 为标准，筛选 出5 份 低 氮 敏 感 材 料ZY004093、ZY000304、ZY004101、ZY004058 和ZY004106。

表3 19 份燕麦种质干重耐低氮系数Table 3 Low nitrogen tolerance coefficient of dry weight of 19 oat germplasms

2.2 不同氮处理下燕麦种质各性状基因型差异

不同氮处理下，燕麦种质各性状的变异系数都比较大，表明不同种质间耐低氮性差异大(表4)。常规组的变异系数范围为10.700%～95.673%，其中以根体积、根表面积、根尖数、平均直径和最大根长较大；低氮组的变异系数范围为7.314%～60.991%，其中以根体积、根表面积、最大根长、平均直径和茎叶干重较大。比较耐低氮系数，各指标变异范围为8.162%～91.821%，其中以根体积、根表面积、平均直径、根尖数和根干重较大。低氮处理后，除植株干重、最大根长和平均直径，其余各指标均发生了显著变化，具体表现为茎叶干重、株高、叶片SPAD值显著降低，分别较常规氮处理下降16.296%、11.925%和17.348%；根干重、根冠比、根体积、根表面积和根尖数显著增加，分别较常规氮处理高51.724%、87.383%、57.143%、37.639%和102.507%。

2.3 燕麦耐低氮性综合评价

2.3.1 燕麦耐低氮性状的综合评价

对燕麦各性状的耐低氮系数进行主成分分析(表5)，在所选11 个性状中，前3 个主成分的方差贡献率分别为42.238%、31.604% 和11.415%，累计达85.257%。第1 主成分主要由植株干重、茎叶干重、根干重和株高决定，系数分别达0.958、0.925、0.797和0.788，说明此主成分主要反映低氮胁迫下燕麦的生物量变化。第2 主成分中，根体积、根表面积、平均直径和根尖数的载荷系数较大，分别为0.730、0.889、0.746 和0.794，说明此主成分主要反映低氮胁迫下燕麦根系形态的变化。第3 主成分中根冠比的载荷系数最大，为0.787，说明该主成分主要反映低氮胁迫下燕麦地上干物质和地下干物质的分配情况。基于上述主成分，分析燕麦各性状耐低氮系数与综合评价值(D) 的相关性(表6) 可知，株高、茎叶干重、根干重、植株干重、根表面积和根尖数与D 值呈显著或极显著正相关；而根体积、根直径和根冠比与D 值相关性未达显著水平，所以剔除根体积、根直径和根冠比3 个性状。通过方差分析(表4) 可知，植株干重在低氮和常规氮下差异不显著，故剔除植株干重。综上得出，评价燕麦低氮耐受性的最佳性状为株高、茎叶干重、根干重、根表面积和根尖数。

表6 燕麦各性状耐低氮系数与D 值的相关性Table 6 Correlation of the D-value with low nitrogen tolerance coefficient of oat traits

2.3.2 燕麦耐低氮种质的综合评价

在燕麦各性状耐低氮系数的基础上，通过公式(2) 计算各种质3 个主成分的综合指标值，并对其进行隶属函数分析，通过3 个主成分的贡献率确定权重大小，最后结合隶属函数和权重计算各种质的D 值。D 值越高，表明其耐低氮能力越强，10 份材料D 值由高到低为ZY004067 ＞ ZY004068 ＞ZY004071 ＞ ZY004106 ＞ ZY004058 ＞ ZY000304 ＞ZY003178 ＞ ZY004093 ＞ ZY004101 ＞ ZY004085 (表7)，其 中ZY004067 和ZY004068 的D 值 高 达0.965 6 和0.913 8，表明二者耐低氮能力极强，ZY004085 的D 值最小，仅为0.272 2，其耐低氮能力差。进一步采用平方欧氏距离法对D 值进行系统聚类，将10 份燕麦材料聚为3 类，分别为耐低氮型、中间型和低氮敏感型(图1)。耐低氮型材料有2 份，分别为ZY004067和ZY004068；低氮敏感型材料有3 份，ZY004085、ZY004101 和ZY004093；其余为中间型材料。

图1 10 份燕麦种质耐低氮能力的系统聚类图Figure 1 Dendrogram of 10 oat germplasms based on low nitrogen tolerance

表7 燕麦种质的D 值Table 7 The D value of oat germplasms

3 讨论

3.1 低氮对燕麦苗期农艺性状的影响

氮素是植物体正常代谢和生长的关键因素[23]，氮素的缺乏会导致植物体发生一系列的变化。植株地上部分的表观可以直接反映其生长状况，试验结果表明，供试燕麦种质苗期各性状在两种氮水平下差异显著，在低氮胁迫下，燕麦种质的茎叶干重、株高、叶片SPAD 值显著降低。这与前人研究结果一致[24-25]，说明低氮胁迫对植物幼苗地上部分的生长及叶绿素的合成具有抑制作用。根系在植物适应各种环境、获取有效养分和水分过程中具有十分重要的作用[26-27]，氮素通过根系吸收才能进入燕麦体内，所以在低氮胁迫下，燕麦根系会首先做出反应。本研究中，低氮胁迫下，大多数燕麦种质的根干重、根冠比、根体积、根表面积和根尖数显著增加，这与远月丽等[28]和汪晓丽等[29]研究结果一致，说明低氮胁迫可以促进植物根部发育，低氮条件下植物幼苗通过扩增根系来获取更多的氮素，用于植物的生长发育[30]，这也是燕麦应对低氮胁迫的一种措施。

3.2 燕麦苗期耐低氮种质筛选

耐低氮种质的筛选离不开适宜的评价指标。目前，针对作物耐低氮性的评价指标尚未统一，不同作物的评价指标不同。植物对氮素比较敏感，缺氮会导致植物体一系列表型性状发生直接或间接的变化[28]。本研究首先将茎叶干重和植株干重这两个容易测定的表型性状作为评价燕麦耐低氮能力的初级筛选指标，并筛选出了5 个耐低氮种质ZY004085、ZY004067、ZY004068、ZY004071、ZY003178和5 个低氮敏感种质ZY004093、ZY000304、ZY004101、ZY004058、ZY004106。众多研究者通过单一指标(主要是生物量)评价作物的耐低氮能力[31]，然而单项指标并不能准确地反映不同作物品种的耐低氮能力，因此仅用茎叶干重和植株干重来评价燕麦种质间耐低氮能力较为片面[11]。为了更加合理地筛选出评价燕麦耐低氮能力的指标，本研究复筛时采用多个相关指标进行综合评价，通过主成分分析初步得到与氮素含量密切相关的性状：茎叶干重、植株干重、根干重、株高、根体积、根表面积、平均直径、根尖数和根冠比，再通过相关性分析和方差分析去掉相关性较低和差异不显著的性状：根体积、根直径、根冠比和植株干重，最终得出评价燕麦低氮耐受性的适宜指标为株高、茎叶干重、根干重、根表面积和根尖数。祝令晓等[21]认为，作为低氮耐受性的评价性状应当具备易获得性、可靠性、普适性，本研究获得的评价指标基本满足以上3 个要素。

不同燕麦基因型对氮素的敏感性存在明显差异[32]，筛选耐低氮种质是挖掘燕麦自身的氮利用潜力，最大限度地发挥其优势的重要途径。目前，主成分分析、隶属函数和聚类分析是筛选耐低氮种质常用的方法[12,22]。为获得更准确且具有说服力的结果，研究者已将主成分分析和隶属函数两种方法结合[33]，用于筛选耐低氮种质。本研究首先基于燕麦种质不同性状的耐低氮系数，进行主成分分析并在主成分分析结果上运用隶属函数法，综合评价不同燕麦种质的耐低氮性。基于隶属函数法计算的耐低氮性综合评价值(D) 将不同基因型燕麦分类。结果表明，ZY004067 和ZY004068 为耐低氮型种质，ZY004085、ZY004101 和ZY004093 为氮敏感型种质。本研究筛选出了2 份耐低氮种质，但此结果仅能说明其在苗期对低氮的耐受力较强，并不能代表成熟期的耐低氮能力。因而，为更确切地评价燕麦种质耐低氮能力，还需进行田间试验来验证。

4 结论

低氮胁迫对燕麦幼苗地上部分的生长及叶绿素的合成具有抑制作用，但会促进燕麦根系生长。株高、茎叶干重、根干重、根表面积和根尖数是评价燕麦耐低氮性的重要指标。供试材料中，ZY004067和ZY004068 为耐低氮型种质，ZY004085、ZY004101和ZY004093 为氮敏感型种质。