液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法测定中药样品中的4种砷形态

张 雯，徐 丽，刘德晔，张琳昀*

（1.江苏省疾病预防控制中心，江苏 南京 210009；2.驻马店市食品药品检验所，河南 驻马店 463000）

中药材中的重金属及有害元素的污染一直是国内外普遍关心的问题[1]。随着检测技术的进步，仅测定中药材中的重金属总量已不能满足监测其毒性的要求。同一元素的不同化学形态其毒性存在很大差异[2]。砷是一种广泛存在于自然界中的重金属[3-4]，砷对人体的毒性不仅与其总量有关，更与其存在形态有关。砷存在的主要形态可分为有机砷和无机砷两大类，无机砷主要包括砷酸盐[As（V）]和亚砷酸盐[As（III）]，有机砷包括一甲基砷（MMA）和二甲基砷（DMA）等，无机砷的毒性比有机砷的毒性强，而在海洋生物中富集较多的有机砷如砷胆碱（AsC）和砷甜菜碱（AsB）等毒性相对较小[5]。研究发现，砷各种形态的毒性大小依次为As（III）>As（V）>MMA>DMA>AsB。无机砷化合物已被国际癌症研究机构确认为I类致癌物[6]。无机砷摄入过量易导致皮肤、神经、消化、生殖、免疫系统等损伤，更加严重的会导致肝癌、皮肤癌等癌症的发生[7]。2020年版《中华人民共和国药典（一部）》规定了 28种中药材及6个中成药中重金属及有害元素限量，《药用植物及制剂 进出口绿色行业标准》规定中药重金属的一般限量标准为砷≤2.0 mg/kg[8-9]。考虑到无机砷的高毒性，中药中砷的限量标准显然不够完善。

常用的砷形态的测定方法主要是食品安全国家标准GB5009.11-2014[10]中的第一法液相色谱-原子荧光法（LC-AFS）[11-12]和第二法高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（LC-ICP-MS）[13-15]，以上两种方法亦可作为中药材中无机砷测定方法。除此之外还有高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱法（HPLC-ICP-MS/MS）[16-17]，但由于仪器昂贵，运行成本较高，难以被普及。本研究在国标第一法LC-AFS方法上进行改进，优化了前处理条件，采用Princen砷形态快速分析柱，选择合适的试剂条件和仪器参数，建立一种能同时测定中药材样品中As（III）、As（V）、DMA和MMA 4种砷形态的方法，对完善中药材中无机砷的限量标准，正确评估土壤环境中砷的污染程度有重要价值，也可为食品和环境监管提供数据支持。

1 仪器与试药

1.1 仪器

DHG-9076A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏）；DEENA3型全自动石墨消解仪（上海仪真）；3-18ks型高速离心机（德国Sigma公司）；E180H型超声波清洗机（德国Elma公司）；Elspe-2型液相色谱仪（广州谱临晟）；BAF-4000型原子荧光光谱仪（北京宝德）。

1.2 试药

砷酸根[A s（V）]标准溶液（编号：GBW08667，17.5 μg/g），亚砷酸根[As（III）]标准溶液（编号：GBW08666，75.7 μg/g），MMA标准溶液（编号：GBW08668，25.1 μg/g），DMA标准溶液（编号：GBW08669，52.9 μg/g，中国计量科学研究院）；盐酸，硝酸（优级纯，南京化学试剂股份有限公司）；磷酸氢二钾（分析纯，南京化学试剂股份有限公司）；氢氧化钾，氨水，硝酸铵（分析纯，国药集团）；硼氢化钾（分析纯，旭日成化学）；高纯氩气（纯度≥99.99 %，南京文达特种气体有限公司）；0.45 μm水系滤膜；50 ml聚丙烯离心管。实验用水均为超纯水。本研究所用的中药材均为河南省驻马店市市场监督管理局抽检样品。

2 方法与结果

2.1 LC-AFS条件

2.1.1 LC条件 色谱柱：Princen砷形态快速分析柱（As Spec Fast Analysis Column，4.6 mm×50.0 mm，5.0 μm）；保护柱：Princen保护柱（As Spec Guard Column，4.6 mm×50.0 mm，10.0 μm）；载气：氩气，压力：0.15 MPa。流动相：流动相A：5 mmol/L 磷酸氢二钾+1 mmol/L硝酸铵，氨水调节pH 10.9；流动相B：25 mmol/L磷酸氢二钾+40 mmol/L硝酸铵，氨水调节pH 9.2； 梯度洗脱程序：0～102 s，100 %流动相A；103～241 s，100 %流动相B；242～360 s，100 %流动相A。流速：1.2 ml/min；进样量：100 μl。

2.1.2 AFS检测条件 载流：5 %盐酸溶液；还原剂：0.5 %氢氧化钾溶液+1.5 %硼氢化钾溶液；负高压：290 V；灯电流：60 mA；辅助电流：60 mA；载气流速：400 ml/min；辅助气流速：800 ml/min。氢气发生器流量：100 ml/min。

2.2 4种不同形态砷含量测定法

2.2.1 标准溶液的配制 准确称取亚砷酸根[As（III）]1.3210 g、砷酸根[As（V）]5.7150 g、MMA 3.9880 g、DMA标准溶液1.8904 g，分别置于10 ml量瓶中，加水定容。所得溶液中As（III）、As（V）、MMA、DMA浓度均为10 μg/ml。分别准确吸取各形态砷标准溶液（10 μg/ml）各1 ml于10 ml量瓶中，加纯水定容，得1.0 μg/ml混合标准溶液（以不同形态的砷计）。

2.2.2 不同形态砷含量测定 称取烘干粉碎后的中药试样0.5 g，置于50 ml消解罐中，加入0.15 mol/L硝酸溶液20 ml，浸泡过夜，经全自动石墨消解仪90 ℃热浸提2.5 h，每0.5 h振摇1 min。提取完毕后，提取液冷却至室温，8000 r/min离心10 min，吸取上层清液，0.45 μm滤膜过滤后上机测定。同时按同一操作方法制备空白溶液。按2.1.1项下色谱条件进样，按2.1.2项下条件检测。

2.3 总砷测定

参考GB 5009.11-2014《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》中的原子荧光光谱法，称取烘干粉碎后的中药试样1.0 g，置于坩埚中，加入硝酸镁溶液，混匀，再加入1 g氧化镁覆盖样品，于电炉上炭化至无黑烟后，移入550 ℃马弗炉灰化4 h，待样品冷却后加入盐酸溶液中和氧化镁并溶解灰分，转入25 ml量瓶中，加入2 ml硫脲-抗坏血酸溶液后定容至刻度，混匀放置后，按2.1.2项下条件测定总砷含量。

2.4 检测条件的优化

2.4.1 前处理方法的优化 GB 5009.11-2014液相色谱-原子荧光光光谱法[10]测定无机砷中，样品提取方式为90 ℃热浸提2.5 h，每0.5 h振摇1 min，需在干燥箱加热，手动振摇。采用全自动石墨消解仪，可自动设置程序完成升温、每0.5 h振摇1 min以及降温的整个过程，试验结束后自动冷却，自带的特氟龙消解罐能四周加热，保证受热均匀，且无需人为操作。以当归为对象，对比以往文献中使用较多的60 ℃超声加热1 h[16]、90 ℃干燥箱热浸提2.5 h及90 ℃全自动石墨消解仪提取2.5 h 3种提取方式，计算3种方式下提取出的砷的总量，结果见图1。结果表明，60 ℃超声加热1 h提取效率最低，90 ℃干燥箱热浸提及全自动石墨消解仪提取效果相当，由于全自动石墨消解仪操作方便，综合考虑，选择此种消解方式。

图1 不同提取方式下的4种砷形态测定值

2.4.2 色谱柱的优化 试验对比了两种色谱柱，即Hamilton PRP-X100阴离子交换色谱柱（250 mm×4 mm）和Princen砷形态快速分析柱（150 mm×4 mm）对同一浓度的无机砷标准品的分析结果。结果显示两种色谱柱均能有效分离4种砷形态组分，但出峰时间差异较大。两种色谱柱各组分的出峰时间对比见图2。使用Hamilton PRP-X100阴离子交换色谱柱,4种砷形态出峰时间需近1200 s，分析时间较长，而使用Princen砷形态快速分析柱可将分析总时间控制在360 s内，可见Princen砷形态快速分析柱分析速度快，检测效率高，且各组分分离良好。

图2 两种色谱柱各组分出峰时间对比

2.4.3 流动相的选择 处理后样品中的砷是以阴离子形态存在的，实验应选择阴离子交换色谱柱进行分离。基于国标方法，选择磷酸盐溶液作为流动相，流动相的pH值是决定分离效果的影响因素之一。由于经过前处理后的样品溶液呈酸性，进入色谱柱会影响样品的保留能力和分离度，为了中和样品的酸性，选择碱性的流动相可达到更好的分离效果，同时可延长色谱柱寿命。结果显示，流动相的碱性较弱不利于峰的分离，若碱性过强（加入氨水调节pH值），则本底值上升。综合考虑，确定流动相A：5 mmol/L磷酸氢二钾+1 mmol/L硝酸铵，pH 10.9；流动相B：25 mmol/L磷酸氢二钾+40 mmol/L硝酸铵，pH 9.2，采用梯度洗脱，保证良好的分离效果。

2.4.4 AFS检测条件的优化

2.4.4.1 载流的浓度 实验过程中，载流与硼氢化钾反应生成氢气，将三价砷还原成气态氢化物，一般选择盐酸溶液。以20 μg/L混合标准溶液为考察对象，分别考察了3 %，4 %，5 %，6 %，7 %盐酸溶液作为载流对待测物峰面积的影响，结果见图3。盐酸浓度为3 %时，4种待测物峰面积明显偏低，随着浓度增加，峰面积逐步上升，后趋于平衡，以6 %，7 %盐酸为载流时的峰面积与以5 %盐酸为载流时基本保持一致，证明5 %盐酸溶液即可满足要求，故实验选择5 %盐酸溶液为载流。

图3 盐酸浓度对4种砷形态峰面积的影响

2.4.4.2 硼氢化钾的浓度 确定用5 %盐酸溶液作为载流后，以20 μg/L混合标准溶液为考察对象，分别考察了氢氧化钾溶液浓度为0.5 %，以1 %，1.5 %，2 %，2.5 %，3 %硼氢化钾溶液作为还原剂对峰面积的影响，结果见图4。由图4可见，随着硼氢化钾浓度的升高，4种砷形态的峰面积明显增大，当浓度达1.5 %后，峰面积趋于平稳，说明1.5 %硼氢化钾溶液即可满足要求，故选择1.5 %硼氢化钾溶液为还原剂。

图4 硼氢化钾溶液浓度对4种砷形态峰面积的影响

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性实验 分别吸取2.2.1项下4种砷形态混合标准溶液（1.0 μg/ml）及2.2.2项下阴性样品溶液（空白溶液）、当归样品溶液各100 μl，按2.2项下方法进样测定，色谱图见图5。结果表明，4种砷形态成分均达到基线分离，与其他成分间均无明显干扰，表明检测方法的专属性良好。

图5 专属性实验图谱

2.5.2 线性范围及相关系数 精确吸取一定体积的混合标准溶液，分别用0.15 mol/L硝酸溶液配制浓度为0，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0 μg/L的系列标准溶液，按2.2项下方法检测，记录色谱图。分别以4种砷形态的浓度（μg/L）为横坐标，以其对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。方法的线性方程和相关系数见表1。在选定的色谱条件下，标准曲线在1～50 μg/L范围内线性良好，相关系数（r）均>0.999。

表1 方法的线性范围、线性方程、检出限及定量限

2.5.3 检出限和定量限 采用逐级稀释的方式，以3倍基线噪声时砷形态的浓度为检出限（S/N=3），以10倍基线噪声时砷形态的浓度为定量限，结果见表1。实验中如称取固体样品1.0 g，定容至20 ml时，As（III）、As（V）、DMA和MMA的检出限依次为0.00370，0.00446，0.00156，0.00196 mg/kg，定量限依次为0.0123，0.0149，0.00520，0.00654 mg/kg。完全可满足中药样品中无机砷的分析要求。

2.5.4 精密度和回收率试验 精密称取已测得砷含量的当归样品0.5 g，分别准确加入低、中、高3个浓度水平的4种砷形态混合标准溶液，根据已优化的实验条件对加标样品做回收率试验，加标回收率范围为96.7 %～101.9 %。每个浓度制备6个平行样品，进行精密度试验，计算相对标准偏差（RSD），结果见表2。结果表明方法的准确度和精密度均符合检测要求。

表2 当归样品回收率及RSD值

2.5.5 稳定性实验 取同一批当归样品，加入一定浓度的砷混合标准溶液，按2.2.2项下方法处理，置于4 ℃条件下，分别于0，2，4，6，8，12 h，按2.1.1项下色谱条件进样，按2.1.2项下条件检测。经测算，As（III）、As（V）、DMA、MMA峰面积RSD依次为2.1 %，1.9 %，0.9 %，1.6 %，表明样品溶液在4 ℃条件下放置12 h基本稳定。

2.6 实际样品分析

采用本方法测定市售的7种28批次的中药材中的4种砷形态，同时测定其总砷含量，计算其无机砷含量与总砷含量的百分比。结果见表3。

由表3可见，各批次样品均未检出MMA，仅有黄芪和黄芩中的2批次检出少量DMA，除了甘草1批次未检出As（III）外，其余批次全部检出As（III）和As（V），说明本次检测的中药材中砷形态主要以As（III）和As（V）存在，且As（V）含量均高于As（III），说明中药样品中的无机砷多以As（V）形式存在。2020年版《中华人民共和国药典（一部）》[8]对中药材的重金属限量要求为砷≤2.0 mg/kg，通过检测中药材中的总砷含量，可看出此次检测的中药材中总砷均未超标，无机砷总量占总砷总量的比例为14 %～93 %，表明各样品中不仅存在不同比例的As（III）和As（V），且有未能检出的其他有机砷形态，但由于无机砷的危害远大于有机砷，所以测定样品中的无机砷即可表明中药材的食用风险。

3 结论

本文采用液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法测定中药材中的4种砷形态。与GB5009.11-2014国标方法相比较，优化了前处理条件，选择了操作更加简便的全自动石墨消解仪，简化了实验操作步骤。同时优选出峰时间更快的Princen砷形态快速分析柱分离样品，使样品在360 s内完全分离，极大地缩短了样品检测时间，节约了试剂和人工成本。本方法检出限低、灵敏度高，各待测组分回收率为96.7 %～101.9 %，RSD均小于3 %，说明方法重复性好，准确度和精密度均能满足方法学要求。综上，本方法在定量分析中药材中As（III）、As（V）、DMA和MMA 4种砷形态中可取得令人满意的结果，值得普及推广。