超声波辅助乙醇提取蔓菁中总黄酮的工艺研究

◎ 杨 悦，吴宇伦，葛 琳，周文静

（青岛工学院，山东 青岛 266300）

蔓菁，学名芜菁，俗称大头菜，又名九英菘、合掌菜、结头菜等，是一种既可作食物，又可以入药的植物。近年来的研究表明，蔓菁拥有独特的营养价值，其药理学研究也正在不断引人关注，有润肺、健胃消食、增强体质[1]等营养价值，这为开发蔓菁保健食品提供了较为充分的理论依据[2]，使得蔓菁在医学领域、食品领域等都具有广阔前景。其中，黄酮是蔓菁中分布较广也较为重要的主要活性成分之一[3]。

目前国内外有诸多关于黄酮的提取方法。其中，超声波技术具有较为先进且功能性强的特点[4]，但有关超声波辅助乙醇提取蔓菁中总黄酮的研究并不多，因此本试验采用超声波辅助乙醇提取蔓菁中总黄酮，研究其总黄酮含量。通过单因素试验和正交试验共同得出蔓菁中总黄酮含量[5]，为蔓菁中总黄酮的发掘和利用提供更多有效的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蔓菁粉末，无腐烂及异味。

无水乙醇（≥99.7%，国药集团化学试剂有限公司）；亚硝酸钠（分析纯，天津盛鑫源化工）；硝酸铝水合结晶体（上海之臻化工有限公司）；氢氧化钠（中石化巴陵石油化工有限公司）；芦丁标准品（UV ≥95%河北硕兴生物科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

101-1 型电热鼓风恒温干燥箱（南昌汇力矿山设备制造厂）；UV2000 型光谱仪（上海甬能实业有限公司）；ALJ200-5DA 型分析天平（北京汉达森机械技术有限公司）；Thermo Heraeus Pico 17 微量高速离心机（上海珂淮仪器有限公司）；BKE-1002DHT 数显小型超声波清洗机（杭州博可超声波设备有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的制备

用电子天平准确称取1.0 g 粉末固体样品，精确至0.01 g，用55%乙醇水溶液作为溶剂，料液比1∶25，在50 ℃、50 W 下超声30 min，通过电动离心机转取后经过滤获得上层清液，移至比色管并用55%乙醇定容至刻度线（25 mL），得到样品提取液。

1.3.2 芦丁标准曲线的绘制

使用电子天平称取一定量的芦丁标准品与无水乙醇混合定容，得到0.2 mg·mL-1芦丁标准溶液。分别量取0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL 和1.0 mL浓度为0.2 mg·mL-1的芦丁标准溶液，置于10.0 mL具塞比色管中，分别添加3.0 mL、2.8 mL、2.6 mL、2.4 mL、2.2 mL 和2.0 mL 无水乙醇于相应试管中，使其总体积不超过3.0 mL，加入5%亚硝酸钠溶液0.5 mL，混匀后放置6 min，加入10% Al(NO3)3，摇匀后再静置6 min[4-8]，再加入浓度为4.0%的NaOH 溶液4.0 mL，超纯水定容，静置15 min，得到最终反应混合液[6]。在508 nm 波长下绘制芦丁标准曲线，以芦丁标准溶液浓度（mg·mL-1）为横坐标，OD508为纵坐标绘制芦丁标准曲线。回归方程式为y=9.7x+0.001 7（R2=0.999 2），线性关系良好。

1.3.3 样品总黄酮测定

用移液枪吸取样品提取液于10.0 mL 具塞比色管内，加入2.7 mL 无水乙醇，按照上述步骤添加同样的试剂、相同的剂量，在同样的反应条件下，得到最终样品溶液。在508 nm 波长下，用未加样品的试管作为空白对照组，测定其吸光值并代入回归方程计算黄酮质量[5]。

式中：X为黄酮化合物总含量，mg·g-1；m为标准曲线计算出的黄酮质量，mg；W为样品质量，g；d为稀释倍数。

1.3.4 蔓菁总黄酮提取单因素试验设计

在预实验的基础上，用电子天平称取1.00 g 蔓菁粉末倒入烧杯中，以不同浓度梯度的乙醇溶液（45%、55%、65%、75%、85%），在不同的超声波功率条件下（60 W、70 W、80 W、90 W、100 W），以不同料液比（1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40）、不同的提取温度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃）提取不同时间25 min、30 min、35 min、40 min、45 min，得到最终提取结果。对得出的相关数据进行深入分析。

1.3.5 优化提取条件正交试验设计

根据对单因素试验结果的测定及数据结果分析，以乙醇浓度、料液比、超声时间、超声功率作为本次试验对象进行正交试验，4 个影响因素中每一个因素设计3 组平行水平，设计正交试验，优化试验最佳提取工艺条件，见表1。

表1 正交因素试验分析表

2 结果与分析

2.1 蔓菁总黄酮提取条件试验分析

2.1.1 乙醇浓度对提取蔓菁总黄酮的影响

由图1 可知，随着乙醇浓度的逐步提高，提取液中总黄酮含量整体呈现上升的动态趋势。然而当乙醇浓度为45%时，样品提取液中总黄酮含量只有0.120 mg·g-1，当乙醇浓度增大至55%，达到试验的峰值0.230 mg·g-1，此时黄酮的提取效果最好。随着浓度的不断攀升，总黄酮含量呈现下滑趋势。

图1 乙醇浓度对总黄酮含量提取的影响图

2.1.2 超声波功率对提取蔓菁总黄酮的影响

由图2 可知，当超声波功率提升至70 W 时，总黄酮含量达到峰值0.240 mg·g-1，此时蔓菁总黄酮的提取效率最高。由试验结果可知，并不是超声波功率越高，总黄酮含量就越高，过高的超声波功率会降低总黄酮含量。

图2 超声波功率对总黄酮含量提取的影响图

2.1.3 料液比对提取蔓菁总黄酮的影响

由图3 可知，随着料液比的逐步提高，提取液中总黄酮含量呈现先上升后下降的动态趋势。当料液比为1∶20 时，提取液中总黄酮含量为0.15 mg·g-1。当料液比减小至1∶25 时，总黄酮含量达到峰值0.260 mg·g-1。当料液比继续减小，总黄酮含量呈现下降趋势。

图3 料液比对总黄酮含量提取的影响图

2.1.4 超声波温度对提取蔓菁总黄酮的影响

由图4 可知，超声波温度低，总黄酮提取量小。当超声波温度为30℃时，提取液中黄酮化合物总含量仅为0.16 mg·g-1。当超声波温度提升至40 ℃，总黄酮含量达到峰值0.28 mg·g-1，此时提取效率最大。

图4 超声波温度对总黄酮含量提取的影响图

2.1.5 超声波时间对提取蔓菁总黄酮的影响

由图5 可知，超声时间不断增加，样液中总黄酮含量整体呈现上升的动态趋势。当超声波时间调整至25 min 时，试样中总黄酮含量较低，当不断延长超声波时间至40 min 时，总黄酮含量达到峰值0.280 mg·g-1。

图5 超声波时间对总黄酮含量提取的影响图

2.2 正交试验结果分析

在对单因素试验结果进行分析的基础上，选定乙醇浓度、料液比、超声时间、超声功率进行正交试验。由表2 可知，乙醇浓度对蔓菁中总黄酮的提取具有重要影响，其R值为0.053，超声功率影响最小，其R值为0.013。试验的最佳提取组合为A2B3C2D3，与正交因素水平表中最佳组合A2B3C1D1不符。经验证试验，A2B3C2D3最终得到总黄酮含量为0.291 mg·g-1，高于A2B3C1D1组合所得到的数据结果0.285 mg·g-1。综上所述，A2B3C2D3为本次试验的最佳组合，即料液比1∶30、超声波功率80 W、超声波时间40 min、乙醇浓度55%、超声温度40 ℃。

表2 正交试验结果表

3 结论

蔓菁的利用价值还需通过多方面的试验进行科学的论证。本试验利用超声波对蔓菁中的总黄酮进行提取试验，研究了超声波提取蔓菁总黄酮的影响因素，并对其相应的影响因素进行调整优化，最终得出乙醇浓度55%、料液比1∶30、超声时间40 min、超声功率80 W 为本次试验最佳条件，最终得出总黄酮含量为0.291 mg·g-1。本次试验可证明蔓菁中总黄酮含量较高。但本试验仍存在许多不足之处，例如是否存在其他提取条件影响最终实验结果，离心时间的长短是否会对提取率造成影响等，此类问题后续将持续探讨。