大黄灵脾颗粒剂质量标准研究 *

陈群力 姚 申 吴 飞

（1.上海健康医学院药学院，上海 201318；2.上海三林社区卫生服务中心全科门诊部，上海 200124；3.上海中医药大学中药现代制剂技术教育部工程研究中心，上海 201203）

大黄灵脾颗粒剂是上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院的院内制剂，处方由大黄、丹参、淫羊藿等多味中药组成，具有温阳活血、泻浊解毒的作用，主要用于慢性肾功能衰竭的治疗，长期临床应用证实其效果显著，能明显延缓肾衰的发展［1-3］，但是现行的定性和定量质量控制较为简单［4］。为了提高产品的质量控制水平，确保其临床疗效，本研究建立制剂中君药淫羊藿的指标性成分淫羊藿苷和臣药丹参的指标性成分丹酚酸B含量的高效液相色谱分析法（HPLC），为其质量标准提高和修订提供依据［5］。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1200 型高效液相色谱仪，含四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器和Agilent ChemStation色谱工作站（美国安捷伦公司）；MS105DU 型分析天平（0.01 mg，梅特勒-托利多仪器有限公司）；FA2104N 型分析天平（0.1 mg，上海精密科学仪器有限公司）；SK5200H 型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；TGL-18C 型高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；Milli-Q型超纯水制备仪［密理博（中国）有限公司］。

1.2 试药 淫羊藿苷对照品（批号：110737-200415，中国食品药品检定研究院），丹酚酸B 对照品（批号：11562-201110，中国食品药品检定研究院）；大黄灵脾颗粒3 批（批号：120416、120522 和130829，均为上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院提供）；磷酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈［色谱纯，默克化工技术（上海）有限公司］；水（自制超纯水）。

2 方法与结果

2.1 淫羊藿苷含量测定

2.1.1 色谱条件 Apollo C18（4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm）色谱柱；流动相乙腈-水（28∶72），流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长270 nm。

2.1.2 对照品溶液配制 取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成0.3836 mg/mL 的对照品溶液母液。精密吸取对照品溶液母液适量，加入甲醇稀释，制成浓度为38.36 μg/mL的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液制备 取大黄灵脾颗粒约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中；精密加入50%的乙醇25.0 mL，超声处理30 min；放冷，再次称定重量；用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 阴性样品的制备 按照处方和工艺制备缺淫羊藿的阴性样品［4］。精密移取2.0 g 阴性样品，按照“2.1.3”项下方法处理，即得。

2.1.5 HPLC测定结果

2.1.5.1 专属性试验 在上述处理方法和液相条件下，分别对淫羊藿苷对照品、大黄灵脾颗粒、大黄灵脾颗粒阴性样品进行测定。结果显示，淫羊藿苷出峰时间在15.8 min 左右，样品中淫羊藿苷与杂质分离良好，阴性样品中相应峰位处无杂质干扰测定，表明本分析方法特异性好、灵敏度高。见图1。

图1 淫羊藿苷测定的高效液相色谱图

2.1.5.2 线性关系考查 取浓度为38.36 μg/mL 的淫羊藿苷对照品溶液，分别进样1.0、2.0、5.0、10.0 μL；取浓度为0.3836 mg/mL 的淫羊藿苷对照品溶液，分别进样2.0、5.0、10.0、20.0 μL，以峰面积对进样质量（μg）进行线性回归计算。

线性方程为：Y=1271X+31.68，r=0.9998。结果表明，进样质量在0.038～7.672 μg 范围内，淫羊藿苷的峰面积与进样质量呈良好的线性相关。

2.1.5.3 精密度试验 精密吸取浓度为38.36 μg/mL 的淫羊藿苷对照品溶液10.0 μL，重复进样6 次，测定峰面积，计算峰面积的RSD 值（RSD=0.5%）。结果表明，仪器进样精密度良好。

2.1.5.4 重复性试验 取大黄灵脾颗粒，按照“2.1.3”项下方法平行处理6 份，进样分析并记录结果，计算峰面积得RSD 值（RSD=0.7%）。结果显示，样品测定重复性良好，颗粒中淫羊藿苷的平均含量为0.4810 mg/g。

2.1.5.5 稳定性试验 取大黄灵脾颗粒，按照“2.1.3”项下方法处理，分别于0、2、4、6、8、10 和12 h 进样测定，计算峰面积的RSD 值（RSD=0.8%）。结果显示，在12 h内供试品稳定性良好。

2.1.5.6 加样回收率试验 精密称取已测定淫羊藿苷含量的大黄灵脾颗粒供试品1.0 g（淫羊藿苷含量为0.4810 mg/g）9份，置锥形瓶中，按低、中、高3个浓度组分别精密加入淫羊藿苷对照品溶液（38.36 μg/mL）0.90、1.20 和1.50 mL，按照“2.1.3”项下方法处理并分析测定。结果表明，此测定方法中淫羊藿苷的平均回收率为98.5%，符合要求。见表1。

表1 淫羊藿苷加样回收率试验结果

2.1.5.7 样品测定 取3 个批次的大黄灵脾颗粒（批号：120416、120522 和130829），按照“2.1.3”项的方法处理并分析测定。结果表明，3 个批次的样品中，淫羊藿苷含量分别为0.4493、0.6104和0.4821 mg/g。

2.2 丹酚酸B含量测定

2.2.1 色谱条件 Agilent Zorbax C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）色谱柱；流动相乙腈-1.7%磷酸溶液（23∶77），流速1.0 mL/min；柱温25 ℃；检测波长286 nm，进样量10.0 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取丹酚酸B 对照品适量，加75%甲醇溶液，制得浓度为1.374 mg/mL 丹酚酸B的对照品溶液母液；以75%甲醇稀释，制得浓度为13.74 μg/mL丹酚酸B的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品适量，研细；精密称定约2.0 g，置具塞锥形瓶中；精密加入25.0 mL 稀乙醇，称重，密封，超声处理30 min；冷却后补足失重，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性样品的制备 按照工艺［4］实验室制备缺丹参的阴性样品。取阴性样品适量，按照“2.2.3”项下方法操作，制得大黄灵脾颗粒阴性样品。

2.2.5 HPLC测定结果

2.2.5.1 专属性试验 分别精密移取大黄灵脾颗粒供试品、大黄灵脾颗粒阴性样品和丹酚酸B 对照品10.0 μL，在上述色谱条件下进样分析。结果显示，丹酚酸B 出峰时间在18.0 min 左右，样品中丹酚酸B 与杂质分离良好，阴性样品中相应峰位处无杂质干扰测定，表明本分析方法特异性好、灵敏度高。见图2。

图2 丹酚酸B含量测定的高效液相色谱图

2.2.5.2 线性关系的考查 精密称取丹酚酸B 对照品适量，制成浓度为0.1374 mg/mL 对照品溶液a 和浓度0.2108 mg/mL 对照品溶液b；精密吸取对照品溶液a 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μL 和对照品溶液b 10.0、15.0、20.0 μL，分别注入色谱仪，记录峰面积；以峰面积对进样质量（μg）进行线性回归计算。

线性方程：Y=605.17X+3.9361，r=0.9999。结果表明，丹酚酸B 进样质量在0.275～4.216 μg 范围内，峰面积与丹酚酸B进样质量呈良好的线性关系。

2.2.5.3 精密度试验 精密吸取浓度为13.74 μg/mL 的丹酚酸B 对照品溶液10.0 μL，重复进样6 次，测定峰面积，计算峰面积的RSD 值。结果表明，丹酚酸B 峰面积RSD为0.4%，表明仪器进样精密度良好。

2.2.5.4 重复性试验 取大黄灵脾颗粒（批号130829），按“2.2.1”项下方法测定，重复测定6 份；计算样品中平均浓度为0.8917 mg/g，RSD 为1.9%。结果表明样品测定重复性良好。

2.2.5.5 稳定性试验 取大黄灵脾颗粒（批号130829），按“2.2.1”项下方法测定，于0、2、4、6、8 和12 h 进样测定，RSD 为1.3%。结果表明，在12 h 内供试品溶液基本稳定。

2.2.5.6 加样回收率试验 取已测定丹酚酸B 含量的供试品约1.0 g（批号130829，丹酚酸B 含量0.8918 mg/g）9 份，精密称定，置锥形瓶中，精密加入丹酚酸B 对照品溶液（1.758 mg/mL）适量（低浓度0.4 mL、中浓度0.5 mL和高浓度0.6 mL），按“2.2.1”项下方法测定。结果表明，此方法丹酚酸B 的平均回收率为97.7%，符合要求。见表2。

表2 丹酚酸B加样回收率试验结果

2.2.5.7 样品测定 取大黄灵脾颗粒3 批（批号：120416，120522 和130829），按照“2.2.1”项下方法处理并分析测定丹酚酸B 的含量。结果表明，3 个批次的样品中，丹酚酸B 的含量分别为0.8611、0.8883 和0.8918 mg/g。

3 讨论

以前，院内制剂的良好疗效主要依靠优质的药材饮片；近年来，随着医药市场需求剧增、药材种植规模不断扩大，大部分药材质量下降较快［6］，而院内制剂对药材检查的质控环节比较薄弱。所以，为保证院内制剂的临床疗效，提升其质量控制势在必行。本研究首次针对院内制剂大黄灵脾颗粒建立淫羊藿苷和丹酚酸B 的含量测定方法，从而保证制剂的临床疗效。

淫羊藿为方中君药，选择淫羊藿苷作为大黄灵脾颗粒的质量控制指标是合理的。淫羊藿在中药复方制剂中被广泛使用，并建立了相应的含量测定方法［7-12］。本实验系统考查了淫羊藿苷的检测方法，并进行了方法学验证。结果表明，本方法的线性、精密度、重复性、稳定性及加样回收率均能满足定量测定的要求。有研究［13］表明，不同植物来源、不同产地的丹参中，丹酚酸B 含量有较大差异。中药制剂中，丹酚酸B 的含量测定方法也已有较多报道［14-21］；但是由于大黄灵脾颗粒的处方组成药味较多、化学组分复杂，故杂质易干扰目标成分的准确定量测定。采用乙腈-1.7%磷酸溶液（23∶77）为流动相，可以取得较好效果。在该色谱条件下，色谱分离度好，峰对称性好，阴性无干扰。与《中华人民共和国药典》收载的甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59）三元混合流动相相比，本方法对仪器的要求较低，具有一定的实用价值。因此，本实验建立的淫羊藿苷和丹酚酸B 的含量测定方法，可用于大黄灵脾颗粒的质量控制，对于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院内制剂的临床再评价和质量标准提高具有重要意义。