基于能量转移的光响应型生物探针在分子医学方面的应用

黄文文，张 玉，李 琪，方兴如，刘洪林

（合肥工业大学 食品与生物工程学院，安徽 合肥 230601）

现代医学已从传统医学时代进入到精密分子医学时代，需要从分子水平上，即通过对DNA、RNA、多肽、蛋白质及代谢产物等的识别、定量与定位等方式来揭示疾病的发生与发展［1-3］。开发各种生物分析方法精准测定疾病相关特定生物分子与相关微环境的变化，并在复杂的生物系统中监测这些动态过程，有助于解析这些生物分子与相关微环境变化在疾病发生、发展与治疗中的作用。生物传感与成像技术具有无创性、近实时反馈、高精度、高可靠性等特点，逐渐成为药物发现、疾病诊断和治疗预后的重要技术手段［4］。在各种生物传感和成像探针中，光谱分析法［5］、荧光分析法［6］和光学成像法［7］等光学方法由于具有高特异性和高灵敏度等优点而被广泛应用。目前已开发出许多能够在细胞甚至单分子水平上监测生物事件发生发展的光学纳米探针，可用于疾病的早期检测、准确诊断和治疗。基于光学纳米探针的生物传感和光学成像具有能够连续监测关键的代谢物、成像灵敏度高（在µmol/L范围内）、成本低等特点，能够提供高分辨率图像，无需使用放射性造影剂、无电离辐射，是一种方便、安全的可视化生物过程和疾病进展的先进实验技术［4，8-11］。光学生物传感和光学生物成像技术能辅助疾病的鉴定与治疗。例如，检测生物标志物变化（如pH值［12-13］），对细胞或代谢产物的种类与含量等进行定位［14-17］与定量分析［18-22］。其中，基于能量转移的光学生物传感和生物成像技术除了具备高特异性和高灵敏度的优点外，还具有灵活精确的距离控制［23］，可以实现更灵敏、更广泛和更精准的传感。上述优点使基于能量转移的光学探针特别适合于研究活细胞体系中的分子事件动态变化，逐渐应用于肿瘤成像、药物筛选和疾病标志物等医学研究与应用。

各种能量转移模式如生物发光共振能量转移（BRET）、化学发光共振能量转移（CRET）、Förster 共振能量转移（FRET）及等离子体参与的纳米金属表面能转移（NSET）和等离子体共振能量转移（PRET）等被广泛应用。其中BRET 使用生物发光蛋白产生的生化能量激发荧光团，是一种基于遗传编码和邻近距离的检测工具，用于研究生物分子间的相互作用，但由于其需要利用遗传编码技术，对含有外源性报告基因的转基因技术的安全性问题阻碍了该技术在人类研究中的应用［24-26］。CRET通过化学发光供体向相应受体进行非辐射能量转移，由于其背景自发荧光可忽略而在生物传感方面显示出巨大潜力，但仍受到其复杂化学偶联和短半衰期发光的限制［27］。FRET是最广泛应用于生物分析、传感和成像的分子标尺，其能量供体和能量受体均为荧光团，但能量转移效率依赖于散射光谱和受体分子吸收光谱之间的重叠程度，且其发生距离在1~10 nm 范围内［28-29］。NSET 效应中的能量供体和能量受体分别是荧光团和等离子体纳米粒子，与FRET 效率高度依赖于能量供体-受体光谱重叠和作用距离范围不同，NSET在光谱重叠方面没有明确的要求，且突破了FRET 作用距离的壁垒，具有更大的距离分辨率，极大地扩展了NSET 的应用领域［30］。PRET 效应中等离子体纳米粒子作为能量供体，荧光团作为能量受体，通过等离子体纳米金属的瑞利散射光谱进行信号反馈，避免了荧光团自猝灭和光漂白现象，具有更高的信噪比和稳定性，在单个纳米颗粒水平的精确跟踪和敏感检测方面具有无与伦比的优势［31］。本文总结了目前基于3种能量转移方式（即FRET、NSET及PRET）的光学探针在分子医学领域的一些应用范例。

1 基于FRET的光学探针及其生物传感和成像应用

1948年，Förster在理论上首次建立了FRET模型［28］。在FRET模型中，能量从供体荧光团转移到受体荧光团，其发生距离在1~10 nm范围内［28-29］。在FRET中，供体和受体均被认为是点偶极子，被激发的供体将非辐射激发能转移给受体。这一过程由高能共振中供体发射和受体吸收的过渡偶极矩之间的偶极-偶极相互作用驱动。FRET 技术非常方便，可在单分子检测极限下常规应用。目前，基于FRET过程，研究人员开发了相关纳米尺模型，其是最广泛应用于生物分析、传感和成像的分子标尺。FRET纳米尺荧光灵敏度高，成本相对低，具有在活细胞中进行实时生物化学测定和多路复用等优势［32］。

1.1 基于FRET的生物传感

基于FRET 能量转移的光学生物传感器已获得广泛应用，其因独特的检测性能在疾病诊断和治疗中发挥着非常重要的作用，可从多种类型的临床标本（体液、细胞、组织）中量化靶标（蛋白质、核酸、代谢物、药物、毒素、人体细胞和其他病原体）［33-35］，用于多种类型的癌症生物标志物监测［36］。快速和高灵敏度的DNA 检测是诊断遗传病的关键，基于FRET 的光学传感器在基因诊断和分析以及癌症风险预测等方面发挥了重要作用。如Wabuyele 等［37］利用单对荧光共振能量转移（spFRET）检测KRAS癌基因的点突变，能够直接从未扩增的基因组DNA 中检测低丰度点突变，处理时间仅为5 min，比传统方法快近100 倍。作者基于连接酶的点突变检测试验，使用等位基因特异性鉴别靶标引物和普通引物，两种引物各具有10个碱基对（bp）的互补臂，在其5'和3'端用荧光染料标记；各有一个能够与点突变的目标DNA 模板链互补配对的臂序列，以供FRET 过程的发生发展。当这两个引物与发生点突变的目标DNA模板链完美匹配时，热稳定的DNA连接酶将两个相邻的引物以共价键形式连接，形成一个分子信标，此时荧光标签距离变近，FRET 发生。相反，未连接的引物不发生FRET。因此，根据FRET 荧光信号的变化，可以鉴别DNA 链是否发生突变，从而推断癌症发生的可能性（图1A）。除了能监测DNA是否发生突变之外，基于FRET 的光学生物传感器还能对极低浓度靶标分子进行量化分析。如Zhang等［38］构建了一种基于FRET 技术的超灵敏纳米传感器，该传感器能够以无分离形式检测低浓度靶标DNA，检测限低至5 fmol/L。该系统使用量子点（QD）与DNA探针相连以捕获DNA靶标链。DNA靶标链与染料标记的报告链结合，从而促使FRET 供体-受体间发生能量转移过程。QD 还被用作集中器，通过将几个DNA 靶标限制在纳米级域中放大目标信号，即使与少量DNA靶标（约50个拷贝或更少）结合，它们也会产生非常明显的FRET 信号，其中未结合的纳米传感器产生接近零的背景荧光（图1B）。这种一个能量供体捕获多个受体的能力不仅有助于提高整体的能量转移效率、放大荧光信号达到高精度检测低丰度靶标，还可以通过荧光信号强度对靶标进行定量研究。蛋白质也是疾病的生物标志物之一，对蛋白质构象变化进行监控有利于了解疾病的发生与发展。Lo等［39］开发了一种时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）生物传感器，用于在高通量筛选（HTS）平台上检测神经退行性疾病相关的一种内在紊乱蛋白（IDPs），即微管结合蛋白Tau（Microtubule-associated protein Tau，Tau）低聚物和单体构象的微小变化。此外，HTS 平台与细胞荧光生物标志物结合，可以应用于开发其它基于IDPs引起的神经退行性疾病的药物（图1C）。近来，Xiao 等［40］利用QD 为能量供体和水溶性AIEgen 染料（（E）-4-（4-（二苯基氨基）苯基）-1-（3-（三甲氨基）丙基）吡啶-1-溴化铝，命名为TVP）为能量受体，设计了一种基于FRET 信号的细胞外囊泡（EV）膜蛋白检测系统（EV－MPDS），该系统消除了EV 的提取和纯化，从而快速简便地诊断肺癌。具体来说，使用TVP 标记EV 膜，附加适体的量子点（AP-QDs）作为特异性蛋白标记探针标记癌细胞分泌的EV 膜上的目标蛋白，利用FRET 技术不分离地检测癌细胞分泌的EV，当FRET 信号开启，表明TVP 和AP-QDs 共同标记同一个EV 粒子膜上，证实此EV 与癌细胞分泌相关，这种双标记系统可用于评估目标EV浓度。与传统ELISA检测方法相比，该系统在癌症诊断方面显示出更高的准确性（100%与65%）和灵敏度（100%与55%），且该系统能够直接从细胞培养上清液或血液中分析EV，消除了复杂的EV提取过程，从而避免了样品的异质性和潜在的误差，具有帮助肺癌诊断和早期筛查的潜力（图1D）。

图1 用于分析KRAS癌基因低丰度点突变的单对荧光共振能量转移（spFRET）检测示意图［37］（A）；基于FRET的单量子点DNA纳米传感器示意图［38］（B）；用于筛选Tau低聚物和单体构象的微小变化的时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）生物传感器检测示意图［39］（C）；基于FRET的EV-MPDS用于准确便捷诊断肺癌示意图［40］（D）Fig.1 Schematic diagram of single-pair fluorescence resonance energy transfer（spFRET） detection for the analysis of low abundant point mutations in KRAS oncogenes［37］（A）；schematic diagram of FRET-based single-QD DNA nanosensor［38］（B）；schematic diagram of time-resolved fluorescence resonance energy transfer（TR-FRET） biosensor detection for screening Tau oligomers and small changes in monomer conformation［39］（C）；schematic illustration of EV-MPDS based on FRET for accurate and convenient diagnosis of lung cancer［40］（D）

1.2 基于FRET的生物成像

基于FRET技术的光学探针可在活细胞体系中可视化相关的分子事件，并且基于FRET的生物成像技术可以利用活细胞成像研究生物系统结构、细胞内微环境变化分析或进行疾病诊断等。如Wen 等［41］报道了一种基于萘酰亚胺－罗丹明的FRET 比例荧光探针用于细胞pH 的感应，该探针通过比例荧光强度精确地响应不同的pH 值，可以根据细胞中不同的荧光信号强度区分癌细胞和正常细胞（图2A）。Lei等［42］开发了一种FRET-肽测定方法，用于分析甲状腺乳头状癌（PTC）和甲状腺结节（TN）患者的各种细胞系和临床甲状腺组织样本中的多重基质金属蛋白酶（MMPs）活性（图2B）。Huang等［14］报道了一种基于FRET的杂交链式反应（HCR），用于在单个细胞和组织切片中高度敏感和选择性地原位可视化肿瘤相关mRNA 的表达。该策略基于3个可编程DNA 发夹结构的使用，即H1、H2和H3 3种发夹结构。H1被设计为包含与靶标TK1 mRNA 互补的序列。在适当的位置分别用荧光受体羧基四甲基罗丹明（TAMRA）和供体羧基荧光素（FAM）标记H2 和H3。在靶标mRNA 存在的情况下，H1 被靶标通过互补配对作用打开，打开的H1 与H2 的粘性末端配对，H2 通过无偏差链位移置换反应打开发夹结构。新暴露的H2 与H3粘性末端配对，打开发夹结构，露出H3上的粘性末端，从而再次打开H2。靶标mRNA 的每个拷贝均可在H2和H3发夹结构之间产生杂交连锁反应，形成有切口的双链体。每对H2-H3杂交事件均会产生FRET 信号，形成级联效应来放大荧光信号。然而，当没有靶标mRNA 存在时，由于各发夹结构是闭合的，保持亚稳态，不发生FRET 过程（图2C）。这种级联效应放大荧光信号策略可以避免多次洗涤步骤，并在一定程度上避免由于探针积累或降解而产生的假阳性信号。半胱天冬酶可通过天冬氨酸特异性裂解多种细胞底物介导细胞凋亡和炎症，与多种疾病密切相关［43］。近来，Procházková 等［44］合成了一种新型的基于FRET 的光稳定荧光探针，在荧光显微镜下对细胞中半胱天冬酶的酶活性进行长期敏感和选择性的监测。此探针由1 个具有半胱天冬酶特异性可切割肽组成，在肽的两侧分别修饰有能量供体QD和黑洞猝灭剂-2（BHQ2），在没有半胱天冬酶时，QD和猝灭剂BHQ2发生FRET，QD激发态能量转移给BHQ2，QD 的荧光信号关闭；当存在半胱天冬酶时，连接QD 和BHQ2 的肽段被切割，QD 和BHQ2的距离超过FRET 作用距离，QD 的荧光信号恢复。根据细胞成像结果，可监测半胱天冬酶活性。这种发光探针比商业产品提供了更长的半胱天冬酶成像时间，在细胞内发光信号的稳定性超过14 天。此探针用QD和BHQ2作为FRET的能量供体-受体，避免了传统荧光团的光漂白和自猝灭，使成像效果更稳定（图2D）。

图2 基于FRET的比例荧光探针通过监测细胞内pH区分癌细胞和正常细胞的工作原理［41］（A）；Au/Ag@SiO2底物的制备及FRET肽微阵列MEF检测MMPs活性的原理［42］（B）；基于FRET的HCR法原位检测TK1 mRNA的工作原理［14］（C）；基于FRET的光稳定荧光探针用于单个细胞内半胱天冬酶活性长时间成像的工作原理［44］（D）Fig.2 Working principle for distinguish cancer cells from normal cells by monitoring intracellular pH in living cells using the FRET-based proportional fluorescent probes［41］（A）；preparation of Au/Ag@SiO2 substrate and the principle of FRET-peptide microarray-based MEF detection for multiple profiling of MMPs activities［42］（B）；working principle for the in situ detection of TK1 mRNA using the FRET-based HCR method［14］（C）；working principle for a long-time imaging of active caspases inside individual cells［44］（D）

现有基于FRET 能量转移构建的传感器或诊疗技术，往往受限于FRET 检测量程（＜10 nm）。并且，FRET 模型中涉及的荧光团不可避免地存在光漂白、自猝灭、可选择性有限等弊端。但是，基于FRET能量转移的光学生物传感和生物成像技术在基础研究和临床诊断等方面仍具有一定的潜力和应用前景。

2 基于NSET的光学探针及其生物传感与成像应用

2005年，Strouse课题组［30］首次报道了NSET模型。在NSET模型中，能量从供体荧光团转移到受体纳米金属表面，其检测量程打破了传统FRET 的障碍，即＞10 nm。在NSET 中，供体荧光团被认为是点偶极子，而受体纳米金属表面被看作薄膜镜面以容纳更多的能量［30］。Strouse 课题组研究表明，对于直径1.4 nm 的金纳米颗粒（AuNPs），NSET 检测量程可扩展到22 nm，这是传统FRET 检测极限的两倍多。与FPRE 分子间的偶极-偶极相互作用机制不同，NSET 过程中存在等离子体纳米粒子，其主要由偶极子-纳米金属表面非辐射能量转移机制驱动，即从分子偶极子转移到纳米金属表面的强相互作用。此外，NSET 的显著优点不仅在于探测距离比FRET 更长，还在于NSET 猝灭效率更高，具有较优异的高信噪比和灵活的检测距离，能够实现更灵敏、更广泛的传感探测与分析［23］。

2.1 基于NSET的生物传感

基于NSET过程构建的生物传感器已被用于疾病相关生物标志物的检测。如Griffin等［45］报道了超敏感的基于金纳米颗粒的NSET 方法用于筛查丙型肝炎病毒RNA，获得了优异的灵敏度（800 fmol/L）和选择性（单碱基对错配）（图3A）。Yuan 等［46］利用4-磺酸苯基卟啉（TPPS4）为能量供体和金纳米棒（AuNRs）为能量受体构建的NSET 平台，高选择性、高灵敏度地痕量检测人尿液中恶性肿瘤标志物精胺含量，用于癌症的早期诊断。当精胺不存在时，具有双链结构的小牛胸腺DNA（ctDNA）对AuNRs 表现出更强的静电相互作用，从而驱使TPPS4 远离AuNRs 表面，使TPPS4 荧光恢复。当精胺存在时，在酸性条件下，精胺表现出多阳离子性质，通过静电吸引和凹槽结合，对ctDNA 阴离子磷酸主链具有很强的亲和性，形成缩聚聚集并从AuNRs 表面释放，TPPS4 被吸附到AuNRs 表面，激发态能量从能量供体TPPS4转移到能量受体AuNRs 上，导致TPPS4 的荧光发生猝灭，且猝灭效率与精胺的浓度成正比（图3B）。Pramanik 等［47］利用罗丹明6G（Rh-6G）染料和金纳米星分别作为能量供体和能量受体构建了基于NSET过程的传感平台，可用于检测和灭活冠状病毒SARS-CoV-2。在没有抗原或病毒存在时，Rh-6G 染料偶联刺突蛋白特异性适配体附着在金纳米星上，此时，Rh-6G 的激发态能量转移给金纳米星，发生NSET，Rh-6G 的荧光信号关闭，当SARS-CoV-2抗原或病毒存在时，由于刺突蛋白特异性适配体与抗原或病毒上的刺突蛋白结合，金纳米星与染料之间的距离增加，荧光信号持续存在。通过NSET 信号变化可以检测抗原或病毒并根据信号强度进行定量研究，且此探针具有快速检测刺突抗原和病毒的能力，可在不到10 min 的时间内获得结果，具有高度敏感性，对SARS-CoV-2 刺突重组抗原的检测限低至130 fg/mL，对病毒的检测限为8颗粒/mL。且作者证明了附着有刺突蛋白特异性适配体的金纳米星可以通过阻断宿主血管紧张素转换酶2受体和病毒的结合以及破坏病毒的脂质膜来阻止病毒感染（图3C）。各种蛋白质之间的受体-配体相互作用对维持正常的生理代谢至关重要，发展原位观察活细胞系统中受体-配体相互作用的策略有助于开发基于适体的诊断方法。基于NSET 过程开发光学纳米尺也被用于测量活细胞膜表面受体蛋白水平上两配体结合位点之间的分离距离。如谭蔚泓院士课题组［48］基于NSET过程开发了一种光学纳米尺，用于测量活细胞膜表面转铁蛋白受体（CD71）上两配体结合位点之间的分离距离。首先采用指数富集的配体系统进化（SELEX）策略获得称为XQ-2d 的ssDNA 适配体，此XQ-2d适配体能特异性结合在腺导管腺癌细胞（PL45）膜表面的CD71 上。使用XQ-2d 适配体修饰一系列不同直径的金颗粒，使用荧光蛋白标记抗体，分别作为能量转移受体和供体构建NSET 纳米尺，来测量XQ-2d和抗CD71抗体在PL45细胞膜表面受体蛋白CD71上两个不同结合位点之间的距离，基于“当金颗粒的半径在2~8 nm 范围内时，r0是常数”的前提，测得两结合位点之间的距离约为15 nm（图3D）。为分子医学的研究提供了一种新的方向。同样地，本课题组基于NSET 过程开发了一种具有单核碱基分辨率的纳米尺，与谭蔚泓院士课题组设计的纳米尺不同，本课题组利用荧光染料标记的适体和单一尺寸的金纳米颗粒-抗体复合物分别作为能量转移供体和受体，在活细胞膜上推断CD71蛋白亚基水平上两个结合配体之间的分子距离［49］。本课题组建立的能量供体-受体体系，降低了材料合成的复杂程度，使用单一尺寸金纳米颗粒提高了制备稳定性和可重复性；相比于荧光蛋白标记抗体，小分子荧光团标记适体更简便快速、成本低廉。另一方面，我们利用单一尺寸的金纳米颗粒与荧光团作为能量转移受体和供体构建的NSET纳米尺，具有确定的r0值。此外，通过在XQ-2d适配体末端修饰带有不同碱基对数目的荧光团，可以精细调控荧光团与金颗粒表面距离，控制分子间距；该纳米尺具有较高的精度，从分子距离的角度，将适体的每个碱基在生物系统的特定平面上进行原位投影，对于建立灵敏、可靠、便捷的基于适体的诊断方法具有重要意义（图3E）。

图3 基于NSET过程的传感器用于筛查丙型肝炎病毒RNA［45］（A）；基于NSET过程的传感平台痕量检测人尿液中恶性肿瘤标志物精胺含量的示意图［46］（B）；基于NSET过程的传感平台用于冠状病毒超灵敏检测与灭活的示意图［47］（C）；基于NSET过程的光学纳米尺用于测量活细胞膜表面CD71上两个配体结合位点之间距离的示意图［48］（D）；利用单核碱基分辨率的NSET纳米尺原位测量活细胞膜上CD71蛋白亚基水平上两个结合配体之间分子距离的示意图［49］（E）Fig.3 Schematic diagram for screening hepatitis C virus RNA based on NSET process［45］（A）；schematic diagram for trace detection of spermine，a malignant tumor marker，in human urine based on NSET［46］（B）；schematic diagram for ultrasensitive detection and inactivation of Corona Virus of the sensing platform based on NSET［47］（C）；schematic diagram for measuring the separation distance between two ligand binding sites on CD71 on the surface of living cell membranes using the optical nanoruler based on NSET process［48］（D）；schematic illustration of in situ measurement of the molecular distance between two binding ligands at the CD71 protein subunit level on the living cell membrane using NSET nanoscale with single-nucleobase resolution［49］（E）

2.2 基于NSET的生物成像

基于NSET 能量转移的光学探针除了能通过检测生物标志物进行疾病诊断，还可通过生物成像技术进行肿瘤成像引导治疗。如Li 等［50］开发了一种基于NSET 模型的纳米探针，不仅能够实时和原位监测癌细胞凋亡，而且能够评估肽诱导的癌细胞凋亡程度和给药治疗效果，因此有望成为癌症成像诊断和后期治疗的靶向载体。在该传感和成像系统中，作者首先合成功能肽包被的金纳米团簇（AuNCs），随后可通过NSET 过程使功能肽上修饰的荧光团处于荧光关闭状态。此外，修饰在AuNCs 表面的肽保留了其固有的结构和生物学功能，在进入癌细胞后可被凋亡蛋白（caspase 3）水解并产生显著的荧光信号。通过监测荧光信号的打开与关闭，分步实现了caspase 3 指示的细胞凋亡的实时成像和通过添加药物前后荧光强度变化评估给药治疗效果的目标（图4A）。Sun 等［51］提出了一种可原位激活并包含阿霉素（Dox）的“纳米簇炸弹（AuNCs/Dzs-Dox）”，由内源性肿瘤细胞过表达的豆科蛋白引爆，利用NSET过程增强肿瘤成像和控制药物释放。利用功能肽作为生物配体，制备了具有靶向性、正电荷和豆科蛋白特异性以及TAMRA 环的AuNCs，此时TAMRA 作为能量供体将能量转移给能量受体AuNCs，TAMRA 的荧光通过NSET 过程被形成的AuNCs 完全猝灭。同时AuNCs 可以保护脱氧核酶（DNAzyme）和Dox 组成的治疗物质（Dzs-Dox），聚集成更大的AuNCs/Dzs-Dox纳米颗粒，这些纳米颗粒通过整合素介导的内吞作用选择性地内化到癌细胞中，然后在溶酶体中豆科蛋白的帮助下局部水解。随后监测到一种“炸弹样”行为和“火花样”荧光，这是由于TAMRA 和AuNCs 的NSET 过程减弱以及Dzs-Dox 的药物释放引起。结果表明，豆蔻素触发的基于NSET 过程的AuNCs/Dzs-Dox 分解方式显著提高了成像对比度。同时，体外细胞毒性实验表明，基于AuNCs/Dzs-Dox 的引爆策略很容易实现有效的基因/化疗联合治疗。此外，通过在体内治疗异种移植的MDA-MB-231 肿瘤模型，进一步证明了联合治疗的超强效果（图4B）。这种治疗性纳米簇炸弹设计利用内源性刺激反应性，建立起多管齐下的成像和给药治疗联用策略，为高对比度成像和按需给药的精确癌症治疗提供了一种新的策略。

图4 基于NSET模型的纳米探针用于caspase 3指示的细胞凋亡实时成像示意图［50］（A）；基于NSET效应的纳米簇炸弹系统（L-AuNCs/Dzs）合成示意图以及用于对比度增强型癌症成像和联合治疗的引爆策略［51］（B）；基于NSET过程的传感器用于监测阿霉素在活细胞内释放的示意图［52］（C）；以CPT为基础的聚合物前药包覆AgNPs的NSET效应示意图［53］（D）Fig.4 Schematic illustration of real-time imaging for caspase 3 directed apoptosis of based on NSET model nanoprobes［50］（A）；schematic illustration of nanocluster-bomb system（L-AuNCs/Dzs） synthesis and the detonation strategy for contrast enhanced cancer imaging and combination therapy based on NSET［51］（B）；schematic illustration for monitoring adriamycin release in living cells based on NSET process sensor［52］（C）；schematic illustration of NSET effect of AgNPs coated by the CPTbased polymeric prodrug［53］（D）

基于NSET 的生物成像技术不仅能用于肿瘤成像引导治疗，还可以利用荧光强度变化进行生物成像来检测细胞内药物的释放，评估治疗效果。Wang 等［52］开发了一种药物递送系统，基于NSET 过程监测细胞内药物释放。通过酸不稳定的连接将Dox 与聚乙二醇间隔物拴在AuNPs 表面，此时，由于Dox与AuNPs 发生NSET，能量从能量供体Dox 转移给能量受体AuNPs，使Dox 的荧光信号关闭；当此偶联物进入细胞并在酸性细胞器中响应性地在细胞内释放Dox 后，荧光信号打开。通过监测荧光信号，可以可视化Dox的细胞内响应释放（图4C）。Li等［53］通过将化疗药物喜树碱（CPT）的光响应性聚合物前药系在银纳米颗粒（AgNPs）表面上，开发了一种混合药物递送系统。当AgNPs被基于CPT的聚合物前药包裹时，CPT 与AgNPs 之间的距离足够近，基于NEST 过程，CPT 的能量转移给AgNPs，使CPT 的荧光被AgNPs猝灭；当混合纳米颗粒释放CPT分子后，CPT的荧光恢复。因此，可以通过观察细胞内CPT荧光强度的变化来追踪细胞内药物释放过程和药物分布（图4D）。荧光强度的变化与药物释放行为息息相关，使得基于NSET的药物传递系统可以追踪细胞内药物释放过程，观察释放的药物在细胞内的分布和治疗效果。因此，基于NSET的生物传感和生物成像在生物化学和分子医学的发展中发挥着重要作用。

虽然基于NSET的光学探针和基于FRET的光学探针均在分子检测和肿瘤治疗等方面应用广泛，但由于NSET打破FRET作用距离的壁垒，基于NSET的光学探针在医学研究领域应用范围更广，比如在构建光学纳米尺方面具有FRET和PRET不具备的绝对优势，有助于开发全新的诊断方法。

现有基于NSET构建的传感器或诊疗技术，虽然其检测量程突破了FRET 量程的壁垒。但仍然存在一些弊端，例如，荧光团的光漂白、自猝灭，金属纳米材料的细胞毒性，关键参数r0的不准确。总而言之，基于NSET 能量转移的光学生物探针和生物成像技术在现代分子医学领域等方面具有重要应用价值。

3 基于PRET的光学探针及其生物传感和成像应用

2007年，Liu等［54］在暗场显微镜下观察到从单个AuNPs到吸附的细胞色素c引起的AuNPs散射光的猝灭，这是PRET过程的首次发现。在PRET模型中，能量转移发生在等离子体纳米颗粒和有机染料之间［55］。与FRET 过程类似，PRET 同样是基于等离子体纳米颗粒供体和受体分子之间通过偶极子-偶极子相互作用的非辐射能量转移过程。当等离子体纳米颗粒的局部表面等离子体共振带的频率与吸附在纳米粒子上或距离纳米粒子几纳米的分子的电子吸收带频率非常匹配时，就会产生瑞利散射信号的相应变化［56］。其能量转移效率在很大程度上取决于等离子体纳米颗粒的散射光谱和受体分子的吸收光谱之间的重叠程度［23］，这与NSET 有明显差异。然而，等离子体纳米材料比荧光分子具有更好的光稳定性和更大的光学横截面［57］，使得PRET 模型具有更高的灵敏度、光谱分辨率以及优异的选择性，并逐渐在光学生物成像方面备受关注。

3.1 基于PRET的生物传感

近年来，基于PRET 的生物传感和生物成像技术已被作为一种非破坏性和无标记的活细胞实时监测方法［58］，不仅可用于蛋白酶活性研究，还可以定量检测生物分子以观察细胞内的动态代谢活动。如基于简单的静电吸附，Yan等［59］利用海胆状的金纳米等离子体（UGPs）和氧化态的3，3'，5，5'-四甲基联苯氨（oxTMB）建立了一种新的PRET 供受体对，用于酸性磷酸酶（ACP）的灵敏检测。当ACP 不存在时，由于oxTMB 的电子共振峰与UGPs 的等离激元共振峰重叠，能量从oxTMB 转移到UGPs 上，使UGPs 的散射强度减弱即发生PRET 过程。当ACP 存在时，ACP 催化2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐（AAP）分解产生的水解产物抗坏血酸水解物（AA）能有效地将oxTMB还原为TMB，从而阻断PRET过程（图5A）。

图5 基于PRET纳米传感器用于酸性磷酸酶灵敏检测的示意图［59］（A）；基于PRET的等离子体纳米探针GNPs@CD对活细胞中NO成像机制的示意图［60］（B）；基于PRET的生物传感器用于血浆中前列腺特异性抗原定量分析的原理图［62］（C）Fig.5 Schematic illustration for sensitive detection of acid phosphatase based on PRET nanosensor［59］（A）；schematic illustration for the imaging mechanism of NO in living cells using the plasmonic nanoprobe GNPs@CD based on PRET［60］（B）；schematic diagram for the quantitative analysis of prostate-specific antigens in plasma using the PRET-based biosensor［62］（C）

3.2 基于PRET的生物成像

基于PRET 的生物成像技术在单个纳米颗粒水平的精确跟踪和敏感检测方面提供了无与伦比的优势。Wang等［60］提出了一种基于PRET过程的传感策略，用于活细胞中一氧化氮（NO）的超灵敏成像。将具有独特刚性结构和环形空腔的超分子环糊精（CD）分子连接在金纳米颗粒（GNPs）上，并对其进行修饰，构建了PRET纳米传感器。在没有NO分子时，罗丹明B衍生物（RdMs）通过疏水相互作用进一步插入到CD 分子的空腔中，形成主客体结构。在NO 分子存在的情况下，RdMs 与目标物反应并生成罗丹明（RdB）。由于GNPs和CD 分子偶联物（GNPs@CD）和RdB 分子之间的光谱重叠，能量从RdB 分子转移到GNPs@CD 上，PRET 发生导致GNPs@CD 的散射强度降低，此传感平台实现了活细胞中外源性和内源性NO分子的单粒子成像分析（图5B）。同样地，此课题组［61］利用基于PRET过程的主客体结构，实现对0.02 ~2.0 µmol/L线性范围内的胆固醇进行检测，并达到6.7 nmol/L的检测限，可直接用于检测血清样品中的胆固醇，具有高灵敏度和特异性。这种基于PRET 的策略为检测胆固醇和其他疾病相关生物标志物提供了一种有效的临床潜在手段。Liu等［62］利用由AuNPs和QD作为供-受体对的PRET生物传感器，前列腺特异性抗原（PSA）作为模型抗原评估基于PRET的均质免疫分析法的性能。结果表明，这种基于PRET 的生物传感器可对血浆中的前列腺特异性抗原进行定量分析，建立了一种无分离的均质免疫测定方法，具有定量各种生物标志物的潜能（图5C）。本课题组利用PRET 过程设计了一种无连接子单分子偶极的PRET 纳米尺模型，在活细胞受体蛋白分子水平上检测了位点间分离距离和蛋白质相互作用［63］。与传统PRET 模型相比，本课题组的无连接模型以单一分子为受体，单一大小的GNPs 为供体，证明了以单分子偶极子为受体的无连接体PRET 模型的可行性，对于未来测量生命系统中的单分子事件具有重要意义。此外，与利用NSET模型检测配体分离距离相比，本课题组构建的基于PRET 的纳米尺避免了染料光漂白的特性，以及不同尺寸的GNPs和染料种类之间不确定r0值，具有观察单分子事件的独特优势，可以作为纳米尺度距离测量的替代工具。

然而，目前基于等离子体纳米粒子的PRET 在大范围光谱检测方面受限，限制了对化学物质的连续跟踪或对活细胞分泌分子的分析［64］。此外，由于单个等离子体纳米粒子具有特定且狭窄的光谱宽度，因此只能检测到吸收峰靠近纳米粒子等离子体共振的分子，可能会破坏用于监测各种类型分子的多路PRET 方法。基于此，Kim 等［65］提出了一个基于PRET 的超表面驱动的多路复用纳米光谱平台。利用间隙等离激元和光栅效应，首次在整个可见光范围内设计了具有工程散射光谱的像素化的超表面，有效地扩大了PRET 检测的光谱范围。3种不同的生物分子（即叶绿素a、叶绿素b和细胞色素c）被应用于超表面作为调色板，以获得选择性分子指纹成像。当元像素散射峰与特定共轭生物分子的吸收频率相匹配时，超表面与生物分子之间会发生强PRET，导致散射谱发生高效率猝灭，通过在整个细胞区域进行连续监测来推进分子传感。该平台可以检测分子之间的电子转移和细胞中ROS 的产生（图6）。这种超表面驱动的PRET高光谱成像，扩大了PRET检测的光谱范围，将为多路实时分子传感和成像方法开辟了一条新的途径，扩大了基于PRET的光学生物传感和生物成像技术的应用范围。基于PRET的光学探针是通过等离子体纳米粒子的瑞利散射光谱变化进行信息反馈，对比基于NSET和FRET构建的光学探针通过荧光信号进行信息反馈，避免了荧光团的光漂白、自猝灭的影响，具有更高的精确度和稳定性。

图6 多路PRET分子成像元表面的示意图［65］Fig.6 Schematic illustration of the metasurfaces for multiplexed PRET molecular imaging［65］

基于PRET 的光学探针在生物传感和分子检测方面具有更优异的精确度，在单个纳米颗粒水平的精确跟踪和敏感检测方面拥有比基于FRET、NSET 的光学探针望尘莫及的优势，这些优点使其在疾病诊断方面具有极大潜力。但在肿瘤治疗或药物递送应用等方面具有极大挑战性，由于基于PRET 的光学探针是通过瑞利散射光谱变化进行信号输出，光谱信号采集受到生物体组织深度的限制。

现有基于PRET 构建的传感器或诊疗技术，具有更高的灵敏度、光谱分辨率以及良好的稳定性。但仍然存在一些弊端，例如，等离子体纳米材料的细胞毒性，PRET 供-受体对的可选择性有限等。总之，基于PRET 能量转移的光学生物传感和生物成像技术在现代分子医学领域等方面仍具有重要应用价值，有望在基础生物医学研究、疾病诊断和治疗等方面得到持续发展。

4 基于能量转移的其它光学探针

除了上述列举的基于FRET、NSET 和PRET 能量转移的光学探针，还有基于金属增强荧光（MEF），也称为表面增强荧光（SEF），以及等离子体增强荧光（PEF）等能量转移的光学探针，其中荧光团与金属纳米颗粒的近场相互作用可能在特定条件下产生较大的荧光增强。这种荧光信号的放大可以大大提高检测灵敏度和增强对比度，从而提高基于荧光的传感和成像技术的性能。MEF/SEF 和PEF 能量转移在生物医学领域的研究越来越广泛，包括生物标志物的检测，如DNA［66］、RNA［67］和蛋白质［68］监测等，免疫测定［69］和肿瘤成像［70］等。但其荧光增强效应受到供体-受体间分离距离的限制，精确的距离控制是诱发荧光增强效应的关键。诱发MEF/SEF过程发生发展的最佳距离在7~8 nm左右［71］，其它距离下，荧光增强效应会减弱或被其它效应掩盖。此外，如要实现实质性的荧光增强效应，除了精确的距离控制，通常还需要金、银和铜等金属作为有效衬底［68］，这些因素大大限制了基于MEF/SEF 和PEF 能量转移的光学生物传感和生物成像技术在现代分子医学早期诊断和治疗等方面的应用。

5 总结与展望

基于各种能量转移的光响应型生物传感和光学成像技术已在疾病研究和临床实践中广泛应用并不断发展。但是，考虑到生物相容性、细胞毒性以及潜在遗传毒性等因素，目前大多数对疾病诊断与治疗方面的研究仍处于实验室层面，需要克服这些问题使研究落实在真实临床诊断和治疗中。因此，基于能量转移的光响应型生物传感和光学成像技术在助力分子医学的成像、示踪和手术导航等方面任重道远，仍需要继续推进、提升和发展。由于能量转移的光响应型生物探针的多优点性和多功能性，这项技术将继续推进临床诊断和治疗的简单性、敏感性、特异性和多路复用性。我们相信基于能量转移的光响应型生物探针具有巨大潜力，将继续为医学研究和应用提供源源不断的动力。