结直肠锯齿状息肉发病机制及微小RNA作用的研究进展

杨凯惠,马瑞军综述 汪嵘审校

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是消化系统常见的恶性肿瘤。据2020年全球癌症统计,结直肠癌居全球发病谱第3位,死亡谱第2位[1]。近年来,我国结直肠癌的发病率和病死率逐年上升。Ⅰ期结直肠癌的5年生存率>90%,但Ⅳ期的5年生存率下降至11%～15%[2]。CRC的发生途径包括腺瘤—癌、炎—癌、denovo-癌、锯齿状息肉—癌。其中,腺瘤—癌途径导致70%～80%的结直肠癌,其典型特征是染色体不稳定和微卫星稳定。锯齿状癌变途径以CpG岛甲基化表型(CpG island hypermethylator phenotype,CIMP)、微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)、BRAF/KRAS突变和WNT通路激活为特点,此种途径导致15%～30%的结直肠癌[3]。miRNA是长度为18～24个核苷酸序列的小分子RNA,可通过影响靶基因mRNA的表达来影响肿瘤的进程,被证明在锯齿状息肉中存在表达失调。文章对结直肠锯齿状息肉的发病机制及miRNA的作用研究进展予以综述。

1 锯齿状息肉分类

直至2010年,人们普遍认为锯齿状息肉(serrated polyps,SP),一般不具恶性潜能。此后,研究者们又创造了许多术语来描述这些病变,增加了对SP术语和分类的误解。2019年第五版WHO消化系统肿瘤分类将锯齿状息肉分为5类,包括增生性息肉(hyperplastic polyp,HP)、无蒂锯齿状病变(sessile serrated lesion,SSL)、无蒂锯齿状病变伴异型增生(SSL with dysplasia,SSLD)、传统锯齿状腺瘤(traditional serrated adenoma,TSA)和锯齿状腺瘤—未分类[4]。新分类法去除了HP亚型中的黏蛋白缺乏型(mucin-poor type,MPHP)。其中,SSL和TSA被认为是癌前病变,具有一定的恶性潜能。SP亚型之间在细胞学、结构特征等方面的差异可能是由负责细胞增殖和分化的基因突变或表观遗传改变引起[5]。

1.1 增生性息肉(HP) HP是最常见的亚型,大多数位于远端结肠,通常<5 mm,约占锯齿状息肉的75%,恶性潜能小,包括微囊泡型增生性息肉(microvescicular type,MVHP)和富含杯状细胞型增生性息肉(goblet-cell rich type,GCHP)。由于内镜下特征相似,这2种亚型的鉴别诊断存在一定的挑战性。在分子水平上,MVHP通常带有BRAF V600E突变和CIMP-H,被认为是SSL的前体,GCHP表现为KRAS突变和CIMP-L。据报道,HP可以在7.5年内发展为SSL或TSA,且位于近端结肠的HP更具恶变潜能[6]。

1.2 无蒂锯齿状病变(SSL) SSL是第二常见的锯齿状病变类型,约占SP的25%,平均大小为5～7 mm,外观为界限不清、形态不规则的苍白病变,组织学上表现为结构扭曲的锯齿状隐窝。BRAF突变和CIMP是SSL典型的分子特征。大约10%的SSL可通过锯齿状癌变途径导致CRC[6]。由于SSL好发于肠道皱褶较多的近端结肠,内镜下不易发现且癌变率较高,因此有研究认为发生在结肠镜筛查后的结直肠癌可能由漏检和未处理的SSL发展而来。

1.3 无蒂锯齿状病变伴异型增生(SSLD) 当SSL恶性进展时,会出现异型增生的关键过渡,有4%～8%的SSL伴有异型增生。在一项包含266例锯齿状病变的研究中,SSLD的中位大小为12 mm,超过20 mm的SSL中有高达32%伴有异型增生,且多伴有MLH1表达缺失[7-8]。因此,MSI可能是SSLD发生的重要机制。

1.4 传统锯齿状腺瘤(TSA) 与HP类似,TSA常位于远端结肠,占锯齿状息肉的1%～2%,组织学上表现为扭曲的绒毛或管状结构伴锯齿状病变。TSA通常较SSL大,在白光下表现为红色、突出、带蒂的外观。与SSL相比,TSA的分子谱具有更大的异质性,其发生恶性肿瘤的风险以及进展为癌的速度尚不清楚。

2 锯齿状息肉的危险因素

目前研究已经确定了一些SP的危险因素。与传统腺瘤相比,年龄较大和男性不是主要的危险因素。一项包含141 143例患者的研究表明,吸烟、饮酒、体质量指数、服用非甾体抗炎药与锯齿状息肉(尤其是SSL)有关联。吸烟人群患SP的风险增加近2.5倍[9],饮酒可使患SP的风险增加33%[10]。与正常体质量患者相比,体质量指数高的患者患SP的风险增加30%[11]。有研究表明,非甾体抗炎药的使用与SSL的发生呈负相关,阿司匹林可将近端结肠SP风险降低约40%[12-13]。有CRC家族史和癌前锯齿状息肉个人史的患者患SSL的风险增加。

3 锯齿状息肉癌变的发病机制

一般认为,锯齿状息肉癌变途径的发生过程是MAPK信号通路相关基因改变(如BRAF/KRAS)引起CPG岛甲基化表型,导致一些肿瘤抑制基因沉默,进而发生MSI引起肿瘤。WNT/β-catenin通路激活也参与肿瘤的发生。CIMP和MSI是表观遗传DNA变化的结果。锯齿状息肉的癌变途径见图1。

注:MVHP.微囊泡型增生性息肉;GCHP.富含杯状细胞型增生性息肉;SSL.无蒂锯齿状病变;SSLD.无蒂锯齿状病变伴异型增生;TSA.传统锯齿状腺瘤;CIMP-H.CIMP高;CIMP-L.CIMP低;MSI-CRC.微卫星不稳定型结直肠癌;MSS-CRC.微卫星稳定型结直肠癌;miRNA.微小RNA。图1 锯齿状息肉的癌变途径示意图

3.1 CPG岛甲基化表型(CIMP) Toyota等[14]于1999年提出这一概念,后来被认为是锯齿状通路中的致癌机制。CPG岛(胞嘧啶和鸟苷酸以一个磷酸连接)是胞嘧啶—鸟苷酸残基以200～1 000 bp的重复序列出现的DNA区域,常位于基因启动子附近区域,大多数处于非甲基化状态,参与基因表达的调控。CPG二核苷酸中的胞嘧啶通过甲基转移酶转化为5-甲基胞嘧啶,诱导DNA空间结构发生变化,使染色质凝缩成团,导致转录因子不能结合,从而引起相关基因沉默。由DNA异常甲基化(即CIMP)引起重要抑癌基因沉默可以促进肿瘤生长。在SSLD中,75%的病例存在MLH1基因及其启动子甲基化[15],被认为是锯齿状通路中最重要的致癌机制。

目前,用来检测CIMP状态的基因组合、实验室技术和标记阈值无通用标准,最简单常用的2种方法是甲基化特异性PCR(MSP)和MethyLight测定(甲基化特异性实时定量PCR),可对CIMP进行分级:CIMP高(CIMP-H)、CIMP低(CIMP-L)和CIMP阴性。CIMP的预后作用在不同的肿瘤分期中可能不同,不同的研究得出了不同甚至相反的结论[16-17]。一项包含15 315例CRC患者生存数据表明:在Ⅲ～Ⅳ期的CRC中,CIMP-H的患者较CIMP-L的患者总体死亡风险增加1.52倍,而在Ⅰ～Ⅱ期CRC中,2组的总生存期无明显差异[18]。除了预后价值外,CIMP在预测化疗疗效中的作用也存在争议,不同的研究结果并不一致。这可能是由于不同CIMP状态的CRC在药物转运蛋白、药物受体、药物代谢酶或与化疗药物药代动力学等相关的基因表达之间存在差异,导致化疗敏感性不同[18]。

3.2 微卫星不稳定性(MSI) CRC中的MSI机制首次在Lynch综合征中被发现。MSI是由DNA错配修复(MisMatch Repair,MMR)基因活性丧失引起的。MMR基因可以识别和修复DNA复制过程中出现的碱基错配、插入和缺失,对维持基因组稳定性具有重要作用。MMR基因在人类中多达12个,最主要的4个基因为MLH1、PMS2、MSH2和MSH6,其中MLH1和MSH2是MMR家族中的主要成员(发生突变占90%以上)。一般使用5个微卫星标记(称为Bethesda组,包括BAT25、BAT26等2个单核苷酸标记和D2S123、D5S346、D17S250等3个双核苷酸标记)来识别MSI状态,当没有标记物改变时,肿瘤被定义为微卫星稳定(MSS),有一个标记物改变时,肿瘤被定义为低度微卫星不稳定(MSI-low,MSI-L),有2个或2个以上的标记物改变时,肿瘤被定义为高度微卫星不稳定(MSI-high,MSI-H)。有研究表明,在具有MSI表型的SSLs、TSA和CRC中,存在多种miRNA及其下游靶基因的异常表达(包括miRNA-5787、miRNA-182-5p、miRNA-200b-3p、miRNA-222-3p、miRNA-6753-3p和SRRM2、POLR2J3、ETF1、MYB、SLC26A3、OLFM4)[19]。一般来说,MSI发生在致癌序列的后期,与SSLD的发生有关。

3.3 MAPK途径信号通路的改变:BRAF/KRAS突变 不同于腺瘤—癌途径,锯齿状息肉很少发生APC突变,最常见的为BRAF突变,偶见KRAS突变[6],并且,这2种突变在锯齿状息肉中是互斥的。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一组能被不同的细胞外刺激,如细胞因子、神经递质、激素等激活的丝氨酸—苏氨酸蛋白激酶,负责把信息从细胞表面传导到细胞核内部。BRAF基因编码一种名为B-raf的蛋白质,在MAPK通路中发挥重要作用。根据BRAF突变的状态可以将结直肠癌分为2种表型:BRAF V600E突变和非V600突变的CRC[20]。在锯齿状病变通路中,BRAF常见的突变位点为BRAF V600E,该突变抑制肠黏膜的正常凋亡,诱导CIMP和MLH1启动子甲基化[6],导致异常隐窝灶转变为MVHP,被认为是肿瘤的早期启动事件。在一项对137例锯齿状病变的研究中,BRAF突变占92.7%[15]。目前,有许多证据表明,部分SSL或HP可以转变为带有BRAF突变的TSA[5]。在锯齿状病变通路中,KRAS突变通常发生在TSA中,多位于远端结肠,表现为CIMP-L或MSS。

3.4 WNT/β-catenin通路 Nourbakhsh等[21]通过使用β-catenin抗体和对下游靶基因(包括C-MYC、MMP7和AXIN2)的测定发现该通路在SSLD中存在激活。在锯齿状息肉中,WNT通路的激活并不常由APC突变引起[13],主要是由RNF43-ZNRF3复合物突变引起的。RNF43是一种下调WNT/β-catenin信号通路的肿瘤抑制基因,该基因的失活意味着WNT通路的激活。Hashimoto等[22]认为WNT通路相关基因突变(主要是RNF43)在SSLD中比SSL中更常见,参与SSLD的进展,并根据MLH1的表达状态具有不同的突变谱。Tsai等[23]的研究表明,RNF43突变在TSA(28%)和BRAF突变MSS CRC(29%)中的发生率较SSL(10%)更高,与BRAF突变密切相关,但在TSA中与KRAS突变呈负相关。

4 miRNA在锯齿状息肉中的作用

Lee等[24]于1993年研究lin-14基因时在秀丽隐杆线虫中发现了miRNA,这是一种内源性的小的非编码RNA(长度18～24个核苷酸),可以与靶基因mRNA的3'-非翻译区(untranslated region,UTR)结合,促进其降解或抑制翻译功能,调节肿瘤进展过程中编码重要蛋白质的基因的表达(如PTEN、PDCD4),参与细胞的增殖、分化、迁移、侵袭、凋亡等过程[25]。在结直肠中,miRNA失调可能会影响结直肠肿瘤的内镜外观和发育途径[26],导致不同类型的息肉的发生。有研究认为,在锯齿状息肉中,SSL和HP的miRNA表达谱相似,并且二者具有相似的基因组特征[27],这可能表明了HP在累积基因突变或表观遗传突变后可以进一步发展为SSL。在锯齿状病变中,miRNA的表达水平与MSI和CIMP状态有关。

4.1 miR-31 许多研究表明,miR-31在锯齿状癌变中起重要作用。Aoki等[28]认为SSL进展为恶性肿瘤可能与miR-31的过度表达有关。Kanth等[29]在锯齿状病变中发现了23个miRNA的差异表达,其中miR-31的表达量较对照组高45倍,较HP高26～129倍,高表达的miR-31与BRAF V600E突变、CIMP-H和晚期肿瘤有关[30-31]。此外,在SSL中有许多差异表达的miRNA,可以将其与HP分开,如miR-31、miR-135b、miR-1247和miR-204。miR-31在锯齿状通路中的潜在机制仍然未知,据报道,miR-31增强了核梭杆菌对自噬通量的抑制,通过靶向抑制4F结合结合蛋白1/2(4F-binding protein 1/2,eIF4EBP1/2)促进CRC细胞增殖[32]。Kubota等[30]认为miR-31抑制SATAB2和RAS p21 GTP酶激活蛋白1(RASA1)来促进上皮—间充质转化(EMT)和上调BRAF表达来促进肿瘤的发展,与肿瘤的晚期和低分化有关,是一种有潜力的预后生物标志物和有希望的治疗靶点。

4.2 miR-135b miR-135b过表达与APC功能障碍有关,促进肿瘤的增殖和侵袭,Kanth等[29]首次显示了miR-135b在SSL中过表达,并且与HP之间存在表达差异。此外,他们对SSL中的miRNA表达进行了全面分析(包括miR-135b、miR-378a、miR-548、miR-9、miR-196b),认为miRNA是SSL转化为癌症的良好预测因子。

4.3 miR-21 miR-21是参与CRC发生发展最为经典的miRNA之一,与肿瘤的TNM分期、组织学类型、浸润深度、淋巴结转移有关,通过下调PTEN和PDCD4等的表达来促进肿瘤细胞的增殖、侵袭[33-34]。Kanth等[29]研究表明,miR-21在SSL中较对照组升高1.5倍,但差异无统计学意义。

4.4 其他差异表达的miRNA 在SSL中,还有许多差异表达的miRNA,如miR-584、miR-3614-5p、miR-378a-3p等[29]。一些miRNA(miR-9、miR-31、miR-196b、miR-584、miR-615)与CIMP-H和BRAF突变高度相关,并且有可能随CPG岛甲基化水平而分级,而miR-196b和miR-615的表达与MSI高度相关[31]。Tsikitis等[35]分析了不同类型结肠息肉的miRNA特征,发现miR-222和miR-214在锯齿状息肉中分别显著下调2.35倍和1.51倍,miR-335在非锯齿状组织中显著过表达2倍,基于这3种miRNA可以将SP与非锯齿状息肉区分开,被认为是锯齿状通路潜在的生物标志物[31],并发现在TSA中miR-125b和miR-199a发生下调。

Slattery等[27]对正常肠黏膜和不同类型息肉之间的miRNA表达谱进行研究,鉴定出了19个在腺瘤性息肉和HP之间差异表达的miRNA,包括let-7i-5p、miR-1229-5p、miR-1234-5p、miR-1249、miR-1268b、miR-1275、miR-194-5p、miR-215、miR-2392、miR-30b-5p、miR-331-3p、miR-3653、miR-3960、miR-4281、miR-4689、mR-4739、miR-518a-5p、miR-6510-5p和miR-939-5p等,认为腺瘤性息肉会上调miRNA的表达。SSL和HP会下调miRNA的表达,并且二者之间的表达差异很小,与MSI和CIMP水平有关。

5 小结及展望

近年来,人们对结直肠锯齿状息肉的研究取得了很大进展,但锯齿状通路仍有不少的空白。文章概述了锯齿状息肉的新分类、命名和发病特征,并对发病机制及miRNA的差异表达进行了初步探讨。基于CIMP、MSI、BRAF/KRAS突变、WNT/β-catenin通路以及miRNA之间的相互关系,锯齿状通路的致癌机制变得更加明确,结合WHO对锯齿状息肉的规范分类、命名,有助于临床医生制定合理的治疗方案。而miRNA在CRC中是一种有潜力的生物标志物和有希望的治疗靶点,在锯齿状通路中的作用仍需进一步探究。